瘦素在特发性肺纤维化中作用及机制研究

摘要

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明慢性进展性纤维化型间质性肺炎，以肺泡结构逐渐破坏并被纤维组织取代为特点，临床表现为进展性呼吸困难及肺功能下降，预后极差，中位生存时间仅2-3年。自噬是一种细胞代谢和自我更新过程，在生物发育和维持机体稳态过程中发挥重要作用，近几年研究发现IPF肺组织中自噬明显受抑制，表明自噬不足在IPF的发生发展中可能发挥作用。瘦素（leptin）是一种可由白色脂肪细胞、胃黏膜细胞、肺泡上皮细胞、肝脏星形细胞等合成和分泌的蛋白，leptin受体有5种异构体，OB-Rb为长型受体，是执行其功能的主要受体，主要在下丘脑核团上高度表达，在一些外周组织如心、肺、淋巴结、肾上腺髓质、肾髓质也有表达。所以leptin除了在营养、代谢、神经内分泌组织发挥功能外，对外周器官也有一定的作用，主要表现在炎症、免疫、自噬调节等方面。多项实验研究显示leptin在肝纤维化、肾纤维化反应中具有调节作用，在肺部慢性炎症性疾病和急性肺损伤后的纤维化反应中具有重要作用；在特发性肺纤维化方面目前无进一步研究。 目的：本研究首先通过体内试验分析leptin在IPF患者血清及组织中的表达情况及其与疾病严重度的相关性；体外实验研究leptin对A549细胞上皮间充质细胞转化的影响，探讨自噬在leptin促进上皮间充质细胞转化中发挥的作用及leptin调控自噬的具体机制；并通过肺纤维化小鼠模型进一步探讨leptin对肺纤维化的调控，最终明确leptin在IPF发病中的作用及机制。 方法：免疫组化（Immunohistochemistry.）检测IPF患者肺组织的leptin表达，酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测IPF患者血清中leptin水平，同时检测参与IPF发病的重要细胞因子转化生长因子β1（Transforming growth factor beta1，TGF-β1）及肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的表达。EBSS（Earle’s balanced salt solution，EBSS）培养细胞，诱导上皮细胞自噬活化，外源性leptin处理自噬活化的细胞，电镜观察自噬小体的形成情况。通过免疫荧光的方法检测处理后细胞表面LC3B点状聚集。蛋白印记法（Western blot）检测自噬相关蛋白LC3B，P62，核糖体S6蛋白激酶（P70ribosomal S6kinase，pS6K）及α平滑肌肌动蛋白（Smooth muscle actin-α，α-SMA），I型胶原（Collagen I）水平。博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型，检测纤维化小鼠血清中leptin水平，及肺组织细胞自噬水平。瘦素受体敲除鼠（db/db）与野生型小鼠（C57BL/6）造模后，比较其急性炎症及肺纤维化程度。 结果：Leptin在IPF患者肺组织中表达较对照组升高，leptin、TNF-α及TGF-β1血清中浓度明显升高；leptin、TGF-β1、TNF-α血清水平与IPF严重度评分呈正相关；IPF患者外周血中TNF-α及TGF-β1水平与leptin水平呈正相关。体外实验结果表明，leptin处理组细胞形态无明显变化，leptin联合TGF-β1处理组细胞梭形改变较TGF-β1组明显；leptin联合TGF-β1处理组细胞内α-SMA及Collagen I蛋白表达明显增加，说明leptin促进了TGF-β1诱导的上皮间充质转化。Leptin抑制了EBSS诱导的自噬小体的增多，EBSS处理后细胞表面LC3B点状聚集较未处理组明显增加，加入leptin后点状聚集减少；EBSS诱导后LC3BII表达上调，P62表达下调，而加入leptin处理组LC3BII表达较前者下调，P62表达较前者上调；pS6K为mTOR活化的代表蛋白，leptin可上调EBSS诱导的pS6K蛋白的表达，上述实验结果表明leptin能够显著抑制EBSS诱导的上皮细胞自噬活化。加入mTOR抑制剂雷帕霉素处理后，pS6K蛋白的表达下调，leptin所致的α-SMA及Collagen I上调被逆转，说明雷帕霉素抑制了leptin的作用，leptin可通过抑制自噬诱导上皮间充质转化。最后，我们检测leptin下游信号通路PI3K/Akt及STAT3的活化情况，加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理后，leptin对pS6K蛋白的上调作用被逆转，说明leptin可能通过活化PI3K/Akt抑制自噬。通过博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型，发现db-/db-鼠及C57BL/6鼠血清leptin水平较正常对照小鼠明显升高，自噬相关蛋白P62表达水平较正常对照升高，提示自噬不足。db-/db-鼠肺纤维化程度较C57BL/6鼠明显减轻。 结论：Leptin在IPF肺组织及外周血的高表达可能与肺纤维化的发展有关。Leptin可以通过上调TGF-β1诱导的A549细胞中α-SMA及Collagen I的表达，加速上皮间充质转化，促进肺纤维化的形成，其机制可能是通过活化细胞内PI3K/Akt/m-TOR信号通路抑制细胞自噬。Leptin功能抑制可以改善博来霉素诱导的肺纤维化。提示leptin抗体或leptin受体抑制剂可作为治疗特发性肺纤维化的靶点。

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