使用改良小鼠RUUO模型研究单侧输尿管梗阻解除后肾纤维化的变化及氯沙坦、Treg对梗阻性肾病的保护作用

摘要

目的： 使用小鼠作模型动物,研究并改良目前的单侧输尿管梗阻后再通(RUUO)动物模型;使用这一改良的RUUO动物模型,探索小鼠解除梗阻后肾脏纤维化的变化;通过改良现有的单侧输尿管梗阻解除(RUUO)动物模型,研究氯沙坦通过调节性T细胞(Treg)从而发挥对梗阻性肾病(ON)的保护作用,为今后临床进一步挽救梗阻肾脏、降低临床患者远期肾功能不全尤其是ESRD的风险提供新的治疗思路和方法. 方法： 第一部分实验：随机将18只C57BL/6小鼠分为套入组(n=6)、套入+置管组(n=6)以及UUO组(n=6);在左侧输尿管结扎术(UUO)后第3天,套入组采用套入法再植输尿管和膀胱,套入+置管组在套入法的基础上增加套管的操作,UUO不进行再通手术;再通手术7天后处死小鼠,比较手术效果. 第二部分实验：利用改良RUUO模型,将观察组40只C57BL/6小鼠随机分为A组(n=10)、B组(n=10)、C组(n=10)及D组(n=10);40只小鼠同时进行UUO手术,UUO术后3天,40只小鼠解除梗阻,并分别在术后第1天,第3天,第7天及第14天处死A组,B组,C组及D组小鼠,分别取术侧肾组织行HE、Masson染色,同时免疫组化检测肾脏α-SMA表达. 第三部分实验：随机将15只C57BL/6小鼠分为手术+氯沙坦组(n=5)、手术组(n=5)、假手术组(n=5).在小鼠一侧输尿管梗阻3天后使用改良单侧输尿管梗阻再通手术方法进行再通手术.术后改良再通手术+氯沙坦组小鼠水给予氯沙坦.单侧输尿管梗阻手术组第3天、改良再通手术后第3、7天检测Treg;梗阻再通术后7天,取患侧肾脏行病理染色,并检测术侧肾组织α-SMA、再通肾脏组织中Foxp3蛋白. 结果： 第一部分实验结果：UUO组所有肾脏均明显积水,肾实质菲薄,肾盂明显扩张.套入+置管组肾脏无明显积水,体积较对侧缩小,色泽较浅,肾盂无明显积水,提示再通成功.套入组小鼠肾脏较单侧输尿管梗阻组小鼠肾脏缩小,但肾脏见少量积水,提示输尿管存在轻度梗阻. 第二部分实验结果：利用改良RUUO模型,我们比较了四组小鼠肾脏积水量.梗阻解除后第1天,A组所有小鼠明显存在肾积水、肾盂扩张、肾实质明显变薄,肾脏体积较对侧肾脏明显增加;梗阻解除后第3天,B组所有小鼠患侧肾盂积水较A组减轻,患侧肾体积较健侧肾脏及A组明显缩小,提示小鼠单侧输尿管梗阻解除手术成功;梗阻解除后第7天,C组所有肾脏积水较B组减轻,肾脏体积较对侧肾脏及B组稍缩小;梗阻解除后第14天,D组所有肾脏体积较A组、B组及C组明显缩小,提示肾脏出现萎缩.从肾小管损伤评分可见B组(4.5±0.71)损伤较A组(4.9±0.32)稍好转,C组最轻(3.3±0.67),D组损伤最重(5.0±0.0);C组与B组相比,D组与C组相比,差异有统计学意义(p＜0.05).A组对侧肾脏及梗阻侧肾脏胶原面积所占比例为0.02±0.25%vs1.26±1.02%(p＜0.05),B组对侧肾脏及梗阻侧肾脏胶原面积所占比例为0.10±0.19%vs0.59±0.44%(p＜0.05),C组对侧肾脏及梗阻侧肾脏胶原面积所占比例为0.14±0.24%vs0.48±0.68%0(p＞0.05),D组对侧肾脏及梗阻侧肾脏胶原面积所占比例为0.06±0.06%vs1.00±1.17%(p＜0.05).A组对侧肾脏及梗阻侧肾脏α-SMA免疫组化的平均积分光密度为16891.4±4491.93vs43248.15±8166.43(P＜0.05),B组对侧肾脏及梗阻侧肾脏α-SMA免疫组化的平均积分光密度为18525.68±13663.49vs40443.40±7178.54(P＜0.05),C组对侧肾脏及梗阻侧肾脏α-SMA免疫组化的平均积分光密度为16319.34±7695.63vs17409.66±9303.38(P＞0.05),D组对侧肾脏及梗阻侧肾脏α-SMA免疫组化的平均积分光密度为18699.12±9759.05vs62197.46±14034.27(P＜0.05). 第三部分实验结果：手术+氯沙坦组病理比梗阻手术组减轻.梗阻手术再通组损伤较梗阻手术再通+氯沙坦组明显严重(4.2±0.81vs2.6±0.57,p＜0.05),假手术组小鼠肾小管损伤评分明显轻于前两组(4.2±0.81vs0.7±0.51,2.6±0.57vs0.7±0.51,p＜0.05).HE染色手术组肾小管结构紊乱、肾小管腔扩大、肾小管腔内可见管型.假手术小鼠组肾小管病理正常.Masson染色示假手术组肾脏组织无蓝染,梗阻再通手术组肾组织明显Masson蓝染集中在肾小管、肾间质,梗阻再通手术+氯沙坦组较前组Masson蓝染减少.梗阻再通手术+氯沙坦组、梗阻再通手术组、假手术组三组胶原比例：5.21±0.72%、10.22±1.25%和1.23±0.48%.上述三组胶原陈积存在明显统计学差别(p＜0.05).肾脏α-SMA在假手术组主要见于小血管壁,肾小球周围和肾小管间质较少.梗阻再通手术组表达明显增多,肾小管间质中为明显增加;梗阻再通手术+氯沙坦组表达量较前组减少.梗阻再通手术+氯沙坦组α-SMA积分光密度比梗阻再通手术组减少0.0129±0.0012vs0.0211±0.0014,P＜0.05),假手术组的α-SMA平均积分光密度低于前两组(0.0129±0.0012vs0.0041±0.0006,0.0211±0.0014vs0.0041±0.0006,P＜0.05).Foxp3蛋白在肾脏组织梗阻解除手术组表达量降低,其积分光密度和内参积分光密度比明显低于梗阻解除手术+氯沙坦组(0.0713±0.0078vs0.6024±0.2912,P＜0.05),也低于假手术组(0.0713±0.0078vs0.9835±0.1503,P＜0.05);手术+氯沙坦组Foxp3蛋白表达量明显低于假手术组(P＜0.05).梗阻后第3天、梗阻解除后第3天、梗阻解除后第7天外周血Foxp3+Treg/CD4+T cell上述不同组间没有统计学差别. 结论： 使用改良手术方法即套入+置管可建立良好的小鼠RUUO动物模型;手术解除梗阻并不是梗阻性肾病治疗的终点;调节性T细胞标志物Foxp3在梗阻解除后模型小鼠的肾脏中表达量下调,外周血变化不明显;氯沙坦能够减轻小鼠RUUO肾脏纤维化,提高肾脏局部组织Foxp3蛋白.

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