硒对DEHP所致大鼠亚慢性毒性的保护作用研究

摘要

研究背景与目的： 邻苯二甲酸酯（Phthalates，PAEs）是在塑料制造中广泛加入的邻苯二甲酸酯的酯化衍生物。增塑剂中，邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP）是最为常用的。DEHP用于增加消费品中聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）的弹性，如建筑材料、装修材料、医疗产品、食品容器、玩具和服装等。预计全球年度DEHP产量在2205至8818亿磅之间。由于DEHP与塑料产品的弱化学结合，解离的DEHP广泛存在于环境中。含有DEHP的产品的数量和种类不同，通过口服摄入，呼吸道吸入，皮肤接触和通过医疗途径静脉内接触都可以发生暴露。DEHP及其代谢物已经在许多人体组织和液体中发现，包括尿液，血清，脐血，母乳，羊水和卵泡液。DEHP在羊水和脐带血中的存在表明它能够到达胎儿。人类接触DEHP令人担忧，因为它是已知的内分泌干扰物质和生殖毒物。研究发现，新生儿的隐睾、尿道下裂、睾丸癌，成年男性的精子质量下降、男性肛门生殖器距离（Anogenital distance，AGD）和睾酮（T）水平降低都与暴露于DEHP有关联。此外，出生前接触DEHP和子宫内膜异位症，性早熟，早期妊娠丧失，性分化异常和低出生体重具有相关性。因此，DEHP暴露于人类的健康风险引起了相当大的关注。 DEHP的睾丸毒性的机制目前尚不清楚，主要包括：过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）激活途径、雌激素受体介导的机制、癌基因激活，以及通过改变负责精子成熟的酶的活性来影响精子发生等，而在这方面越来越多的可能性是诱导氧化应激。氧化应激（Oxidative Stress）是形成活性氧（ROS）与抗氧化防御机制之间的不平衡。ROS在几种重要生理功能的调节中起重要作用，但也解释了可能对细胞有害的变化,如ROS导致细胞损伤，细胞凋亡和细胞死亡。氧化应激也与生殖细胞凋亡和男性不育有关。必需的微量元素硒（Se）是细胞抗氧化防御的关键组成部分，并参与调节细胞内多种形式的细胞硒蛋白的氧化还原平衡。Se参与了从细胞抗氧化防御到DNA凋亡的保护和修复的基本生物学过程。Se对于正常精子的生产也是至关重要的，因此在繁殖中起关键作用。 考虑到Se在睾丸结构和功能上的重要性以及硒摄入不足的频率和DEHP暴露的高可能性，本实验应用DEHP对4～6周龄雄性SD大鼠进行8周染毒试验，同时采用酵母硒进行干预,重点观察其生殖毒性，研究DEHP亚慢性染毒对大鼠的生殖毒性，并研究补硒对邻苯二甲酸酯毒性的保护作用。 研究方法： 将70只健康雄性SPF级SD大鼠适应性饲养3天后，按体重随机分为7组，每组10只。即对照组、3个DEHP染毒组，染毒剂量分别为300、600和900mg/kg b.wt和相应DEHP染毒剂量的3个硒干预组，即在3个DEHP染毒组饲料中分别添加1mg/kg酵母硒DEHP和酵母硒均按相应比例均匀拌入基础饲料中，制成颗粒饲料，将饲料以平均每日动物体重10%的摄食量按组别给予大鼠，连续饲喂染毒8周。染毒期间，大鼠可自由饮水、摄食。 1、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠一般生长发育指标的影响：观察记录大鼠在染毒期间的一般情况（如外观、皮毛、饮水、摄食、大小便和死亡情况等）；每周记录体重、摄食、退食并计算总的食物利用率；对肝、肾、脾、睾丸、附睾进行称重，计算脏器系数，并进行统计学分析。 2、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠血液生化和血细胞的影响：①最后一次染毒期末，大鼠禁食16h后，称重，记录空腹体重。眼眶静脉丛取血，用3.5ml的生化血清管取大鼠全血3.5ml，应用AU640全自动生化分析仪检测总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血清尿素氮（BUN）、血清肌酐（Cre）、碱性磷酸酶（ALP）、血清甘油三酯（TG）、血清葡萄糖（GLU）、总胆固醇（CHOL）等11个生化指标。②最后一次染毒期末，大鼠禁食16h后，称重，记录空腹体重。眼眶静脉丛取血，用滴加EDTA抗凝剂的1.5mlEP管取大鼠全血1.0ml，用ADVIA2120i型全自动五分类血细胞分析仪进行血细胞自动分析。测定白细胞总数（WBC）、中性粒细胞（NEUT）、嗜酸性粒细胞（EOS）、嗜碱性粒细胞（BASO）、单核细胞（MONO）、淋巴细胞（LYM）、红细胞总数（RBC）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞体积（MCV）、红细胞压积（HCT）、平均血红蛋白含量（MCH）、红细胞体积分布宽度（RDW）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、直接测定的血红蛋白浓度（CMCH）、血红蛋白含量分布宽度（HDW）、血小板总数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、血小板压积（PCT）和未染色的大细胞数量（LUC）及其相应百分比等指标。SPSS统计软件分析结果。 3、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠精子运动能力和血清睾酮（T）的影响：①DEHP及硒对大鼠精子运动能力的影响研究：利用大鼠附睾尾制备精子悬液，用计算机辅助精子分析仪（Computer-aided sperm analysis，CASA）测量精子的运动参数，包括：VCL、VSL、VAP、ALH、LIN、STR、BCF、ELON等；②DEHP及硒对血清T的影响：最后一次染毒期末，大鼠禁食16h后，称重，记录空腹体重。眼眶静脉丛取血，用3.5ml的生化血清管取大鼠全血3.5ml，3000r/min离心10分钟分离出血清，用放射免疫法测定血清T水平。 4、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠睾丸标志酶及氧化指标的影响：将右侧睾丸组织利用超声匀浆机制备成睾丸组织匀浆液，离心取上清液-20℃冷冻保存，分别进行谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)以及蛋白浓度的测定。 研究结果： 1、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠一般生长发育指标的影响：染毒期间，300和600mg/kg DEHP剂量组与对照组相比，均未观察到明显的异常；而900mg/kg剂量组的大鼠个别出现局部脱毛（四肢和腹部）；各染毒组的体重随染毒剂量的增加，体重略有下降，900mg/kg剂量组与对照组相比，有明显差异（P＜0.05）。各硒干预组与相同剂量DEHP染毒组相比，体重均有所增加，Se+300mg/kg DEHP干预组与相同剂量DEHP染毒组相比，体重明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；染毒剂量增加到900mg/kg时，大鼠肝、肾、脾、睾丸、附睾的脏器系数与对照组比较均出现较大差异，且差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。 2、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠血生化和血细胞指标的影响：①血液生化指标的影响：与肝肾相关的生化指标在DEHP染毒剂量为300和600mg/kg剂量组时出现异常；与脂类和糖类代谢相关的生化指标中，大鼠TG和CHOL随染毒剂量的增加逐渐降低，900mg/kg DEHP染毒组与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。大鼠GLU随着染毒剂量的增加而升高，Se+600和Se+900mg/kg DEHP干预组与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。②血液血细胞的影响：600和900mg/kg DEHP染毒组，大鼠白细胞（WBC、MONO、LUC）、红细胞（RBC、HGB、HCT、MCH、HDW）及血小板（PLT）相关指标发生异常，而硒的干预对白细胞的改变较明显，对红细胞及血小板的改变不大。 3、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠精子运动能力和血清T的影响：①随着DEHP染毒剂量的增加，VAP、VSL、VCL、ALH、BCF及STR等多项大鼠精子运动参数指标显著降低，而在硒干预组中，则出现了明显的上升趋势。②随染毒剂量的增加，大鼠血清T水平逐渐降低，900mg/kg DEHP染毒组与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），各干预组血清T水平有所上升，Se+900mg/kg DEHP干预组与相同剂量的DEHP染毒组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。 4、DEHP亚慢性染毒及硒对SD大鼠睾丸标志酶及氧化指标的影响：随着染毒剂量的增加，大鼠睾丸组织中SOD、GSH–Px酶活性逐渐降低，MDA含量逐渐增加，与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），硒干预组发生了相反的变化，与相同剂量的DEHP染毒组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。SDH活性随着染毒剂量的增加先升高后降低，，LDH、ALP活性随着染毒剂量的增加逐渐降低，ACP活性随染毒剂量的增加逐渐增加，硒干预组都出现了相应的保护能力。 研究结论： ①通过对SD大鼠进行8周的DEHP亚慢性染毒和同时采用酵母硒进行干预，得出，雄性大鼠的肝、肾、脾、睾丸和附睾都是DEHP毒性作用的靶器官，其中肝、附睾对DEHP毒性作用最为敏感，而硒具有积极地保护作用；②通过对大鼠血生化和血细胞相关指标的检测，DEHP亚慢性染毒对大鼠肝肾相关生化指标和白细胞（WBC、MONO、LUC）、红细胞（RBC、HGB、HCT、MCH、HDW）及血小板（PLT）具有普遍毒性影响，硒的干预具有一定的保护作用；③通过对雄性大鼠精子运动能力和血清T水平的检测，随着DEHP染毒剂量的增加，VAP、VSL、VCL、ALH、BCF及STR等多项大鼠精子运动参数指标显著降低，而在硒干预组中，则出现了明显的上升趋势。随染毒剂量的增加，大鼠血清T水平逐渐降低，各干预组血清T水平有所上升，提示，DEHP扰乱了精子的运动能力，破坏雄性生殖所需的激素水平，而硒在改善DEHP诱导的有害作用方面发挥了积极地作用；④通过研究大鼠睾丸功能相关酶及脂质过氧化损伤作用的指标发现，随着染毒剂量的增加，大鼠睾丸组织中SOD、GSH–Px酶活性逐渐降低，MDA的含量逐渐增加，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），硒干预组发生了相反的变化，与相同剂量的DEHP染毒组相比，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。SDH活性随着染毒剂量的增加先升高后降低，LDH、ALP活性随着染毒剂量的增加逐渐降低，ACP活性随染毒剂量的增加逐渐增加，硒干预组都出现了相应的保护能力。提示，DEHP或其代谢产物引起脂质过氧化损伤，可能是导致睾丸组织损伤的重要机制之一，而硒通过发挥其抗氧化作用，对DEHP所致睾丸组织的氧化损伤起到了一定的保护作用，此外，DEHP还可能会通过影响这些睾丸功能相关酶的活性,造成生精细胞能量供应不足,使生精能力降低，而硒通过提高这些酶的活性可在一定程度上预防DEHP引起的睾丸毒性。

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