IGF-1通过调控miR-193a促进c-kit阳性心脏干细胞迁移和增殖的研究

摘要

本文主要从以下几方面展开论述： 一、IGF-1通过调控miR-193a促进c-kit阳性心脏干细胞迁移和增殖的研究 目的： c-kit阳性心脏干细胞是能促进心血管疾病患者恢复心功能的重要干细胞移植来源之一。但是其移植后的生存能力受多方面的的制约而受到挑战。已有研究证明IGF-1促进移植后心脏干细胞的存活能力从而提高心功能，但具体机制尚不明确。本研究旨在阐明 IGF-1对心脏干细胞的增殖迁移能力的影响及其具体机制。 方法： 第一部分：无菌条件下取2月龄成年C57BL/6小鼠心脏，结合组织块培养法，酶消化法获得心脏干细胞后再经免疫磁珠筛选法进行纯化。用相差倒置显微镜观察细胞的形态学特点，流式细胞仪分析所得细胞表面标记c-kit、Scal-1、CD34、CD45的表达。 第二部分：将获取的 c-kit心脏干细胞分为两组：分别未经 IGF-1的干预和100ng/ml的IGF-1干预72小时。用CCK-8增殖试剂盒和transwell迁移实验检测两组c-kit心脏干细胞的增殖迁移能力。用western blotting和q-PCR检测两组细胞c-kit的蛋白及mRNA表达变化及PI3K/AKT信号通路的介导情况。并用该信号通路抑制剂LY294002逆转上述实验验证上述猜想。 第三部分：采用循环比色法检测经IGF-1干预前后，细胞DNMTs活性变化。采用western blotting检测c-kit心脏干细胞经IGF-1处理后p-Akt、DNMTs(包括DNMT1，DNMT3α，DNMT3β)和c-kit蛋白表达变化；采用q-PCR检测DNMTs、c-kit的 mRNA表达水平改变。并用LY294002逆转上述进行实验验证。亚硫酸氢盐测序法BSP检测DNMTs对c-kit启动子区域甲基化的影响。 第四部分：采用q-PCR检测IGF-1干预后miR-193a表达变化。荧光素酶检测试验检测miR-193a与c-kit基因启动子区域结合情况。慢病毒转染c-kit阳性心脏干细胞过表达miR-193a后，分别用western blotting和q-PCR检测两组细胞c-kit的蛋白和mRNA表达变化，CCK-8增殖试剂盒和transwell迁移实验检测两组c-kit干细胞的增殖迁移能力。 结果： 第一部分：在相差倒置显微镜下观察，可见磁珠筛选后的细胞呈克隆样扩增。流式细胞学分析显示磁珠筛选后的表面标记c-kit阳性CSCs表面标记c-kit阳性率87.42%，Scal-1阳性率为55.97%，而CD34阳性率为1.04%，CD45阳性率为0.95%。 第二部分：在IGF-1干预后，c-kit阳性心脏干细胞的增殖迁移能力较空白组均有所提高。Western blotting检测IGF-1干预后，p-akt和c-kit蛋白表达上均有所提高。采用LY294002逆转后，c-kit蛋白水平及mRNA水平表达及细胞的增殖迁移能力均受到抑制。 第三部分：循环比色法检测IGF-1组的总DNMT，DNMT1，DNMT3β活性较空白组有所增加，而DNMT3α活性没有明显改变。Western blotting检测IGF-1干预后，DNMT1，DNMT3β蛋白表达水平增加，上述效应可被PI3K/AKT信号通路抑制剂逆转。BSP检测c-kit启动子区域甲基化水平结果显示，IGF-1组与空白组没有统计学差别。 第四部分：q-PCR检测miR-193a在IGF-1干预组表达含量较空白组明显下降，该趋势可被 PI3K/AKT信号通路抑制剂及甲基转移酶抑制剂5-aza所逆转。BSP检测 miR-193a基因启动子区域甲基化水平结果显示，IGF-1组明显高于空白组，该现象可被甲基转移酶抑制剂所逆转。同时荧光素酶结合实验结果证明， miR-193a可调控c-kit基因表达。同时转染慢病毒，使之过表达miR-193a,western blotting及q-PCR检测c-kit在蛋白水平和mRNA水平都被抑制，细胞的增殖迁移能力也受到抑制。 结论： IGF-1促进c-kit阳性干细胞增殖迁移的机制，是激活PI3K/AKT信号通路，促进DNMTs的表达，导致细胞内miR-193a基因启动子区域甲基化程度增加，抑制miR-193a的表达，从而促进c-kit蛋白表达增加，最终提高c-kit阳性干细胞迁移和增殖能力。 二、基于3D介孔支架负载缓释IGF-1以促进c-kit阳性心脏干细胞迁移与增殖 目的： 本文设计了一种新型的，带有分级孔结构的3D介孔二氧化硅材料，并将其作为IGF-1这种药物释放的载体，同时3D细胞支架可促进c-kit阳性心脏干细胞迁移与增殖。 方法： 3D细胞支架的分级孔结构可通过SEM、TEM、XRD以及氮气吸脱附曲线进行表征。ELISA检测该材料吸附及释放IGF-1的定量分析。细胞实验使用DNA定量检测试剂盒及transwell迁移实验。动物实验采用小鼠心梗模型及心梗区域注射该材料负载IGF-1和c-kit阳性心脏干细胞，小鼠心脏超声检测左心射血分数及心功能的变化。 结果： 我们制作出了新型带有分级孔结构的3D介孔二氧化硅材料，该材料对IGF-1的吸收量可达到12μg g-1，并且，药物的释放可持续至少250个小时。同时，IGF-1支架促进c-kit阳性心脏干细胞的增殖及迁移的作用则通过DNA定量分析测试以及Transwell测试得出。体内实验证明该介孔材料负载IGF-1和c-kit阳性心脏干细胞相较于单独c-kit阳性心脏干细胞植入组更有利于心梗后小鼠心功能的恢复。 结论： 我们探索出新方法，制作出新型材料，拓展3D细胞支架的生物医学应用，同时实现生长因子的缓释以及高效的细胞增殖迁移率，在体内促进小鼠受损心脏的恢复。

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