活性维生素D经Bmi-1介导在抑制乳腺癌移植瘤生长和骨转移中的作用和机制研究

摘要

乳腺癌是一种常见的女性恶性肿瘤，是全球第二大导致女性恶性肿瘤患者死亡的疾病。乳腺癌的诊断和治疗尽管不断取得进展，但并未整体生存率得到显著提高，主要原因是乳腺癌容易产生远处转移。临床试验表明，骨是乳腺癌最常见的远处转移器官，约70％的乳腺癌患者在自然病程中会发生骨转移。乳腺癌骨转移发生后，由于骨结构的破坏增加，容易发生骨骼相关不良事件，严重影响患者的生活质量。更为严重的是，乳腺癌一旦转移到骨，就无法治愈。一项正在进行的临床研究表明，维生素D缺乏是乳腺癌骨转移的常见危险因素，而维生素D水平正常者发生骨转移的概率显著降低。然而，活性维生素D缺乏在乳腺癌发生和骨转移发生发展中的作用机制未见报道。 研究目的：1)明确活性维生素D在抑制乳腺癌细胞生长和骨转移中的作用；2)明确活性维生素D经Bmi-1介导在抑制乳腺癌移植瘤生长和骨转移中的作用；3)揭示活性维生素D在抑制乳腺癌发生和骨转移的作用机制，为活性维生素D用于临床防治乳腺癌及其骨转移提供实验和理论依据。 研究方法：使用鼠源乳腺癌TM40D细胞株通过外源性1,25(OH)2D3处理，采用CCK-8试验、划痕实验、transwell实验检查不同浓度1,25(OH)2D3对鼠源乳癌细胞TM40D增殖、迁移和侵袭能力的影响；通过直接移植鼠源乳腺癌TM40D细胞株到WT或Cyp27b1-/-雌性小鼠胫骨上端，给予外源性1,25(OH)2D3干预，利用影像学和组织病理学方法分析骨转移瘤的表型变化；建立Bmi-1下调的鼠乳腺癌TM40D稳转细胞株，采用CCK-8试验、划痕试验、transwell试验检查Bmi-1下调对小鼠乳腺癌细胞TM40D稳转细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力的影响；通过直接移植空载体鼠源乳腺癌TM40D细胞株或Bmi-1下调的鼠源乳腺癌TM40D细胞株到WT或Cyp27b1-/-小鼠皮下或胫骨上端髓腔，给予外源性1,25(OH)2D3干预，利用影像学、组织病理学和分子生物学方法分析移植瘤和骨转移瘤的表型变化。 研究结果：1)1,25(OH)2D3体外抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的增殖、迁移和侵袭能力；2)1,25(OH)2D3抑制乳腺癌细胞TM40D在骨组织中生长成瘤和溶骨性骨破坏；3)1,25(OH)2D3抑制乳腺癌细胞诱导破骨细胞骨吸收；4)1,25(OH)2D3体内外能够明显下调Bmi-1在乳癌细胞中的表达；5)Bmi-1下调通过上调P16、P19和P53表达水平，以抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞衰老，从而抑制乳腺癌移植瘤生长；6)Bmi-1下调抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的体外增殖、迁移和侵袭能力；7)Bmi-1下调体内抑制乳腺癌细胞产生的溶骨性骨破坏；8)外源性l,25(OH)2D3和Bmi-1下调均上调抑癌基因在骨转移灶内乳腺癌细胞中的表达。 研究结论：本研究结果说明活性维生素D能够通过下调Bmi-1，激活P16/Rb和P19/P53信号通路，抑制乳腺癌细胞增殖及在骨组织中生长，诱导其衰老，降低乳腺癌细胞的溶骨性骨破坏，从而发挥抑制乳腺癌发生和骨转移的作用。本研究结果不仅揭示了活性维生素D在抑制乳腺癌发生和骨转移中的作用机制，而且为活性维生素D用于临床防治乳腺癌及其骨转移提供了实验和理论依据。

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活性维生素D经Bmi-1介导在抑制乳腺癌移植瘤生长和骨转移中的作用和机制研究

摘 要

研究结果：1) 1,25(OH)2D3体外抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的增殖、迁移和侵袭能力；2)

The Role and Mechanism of Active Vitamin D Mediat

前　　言

材料与方法

一、材料

1.细胞及细胞培养相关试剂及材料

2.Bmi-1 shRNA的提取、逆转录及实时定量PCR相关试剂

3.Western blot相关试剂

4.HE及组化染色相关试剂

5.动物实验相关试剂

8.主要生物信息学分析软件

二、实验方法

1.细胞培养

5.Western blot

6.细胞增殖活力测定

用DMEM溶液将1,25(OH)2D3稀释至终末浓度为10-7M、10-8M、10-9M并用滤菌器无

7.细胞迁移和侵袭能力测定

通过细胞划痕试验来分析细胞迁移能力，研究1,25(OH)2D3对TM40D细胞迁移能力的影响：细胞常

我们利用Matrigel（BD Biosciences，USA）研究TM40D细胞的侵袭能力。实验将

8.小鼠饲养和繁殖

结 果

一、活性维生素D在抑制乳腺癌细胞生长和骨转移中的作用

为了研究活性维生素D在抑制乳腺癌细胞生长和骨转移中的作用，我们首先分别采用CCK-8试验、划痕试验

1.1,25(OH)2D3体外抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的增殖能力

为明确1,25(OH)2D3体外是否具有抑制小鼠乳癌细胞TM40D的增殖作用，我们采用不同浓度的1,

图1. 1,25(OH)2D3抑制乳腺癌细胞系TM40D的增殖

将TM40D细胞在不同浓度(10-7、10-8、10-9M)1,25(OH)2D3作用下培养24、4

2.1,25(OH)2D3体外抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的迁移能力

(A)细胞划痕实验结果显微图像。(B) 各浓度1,25(OH)2D3组内处理24h对乳腺癌细胞迁移的影响。

3.1,25(OH)2D3体外抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的侵袭能力

为了评估1,25(OH)2D3是否具有抑制TM40D细胞侵袭能力的作用，我们利用transwell试

(A)将TM40D细胞与不同浓度的1,25(OH)2D3共培养36h，细胞侵袭实验结果显微图像。(B

4.1,25(OH)2D3在抑制乳腺癌骨转移后的生长成瘤和溶骨性骨破坏中的作用

为了评估内源性1,25(OH)2D3缺乏和外源性l,25(OH)2D3给药对骨中TM40D肿瘤细胞生

为了明确l,25(OH)2D3抑制乳腺癌细胞溶骨性骨破坏作用是否与其抑制乳腺癌细胞诱导的破骨细胞增

图7. l,25(OH)2D3下调Bmi-1在乳癌细胞中的表达

(A)Western blot检测经10-8M浓度的 l,25(OH)2D3处理的TM40D细胞的B

Western blot检测Cyp27b1-/-+l,25(OH)2D3干预组Bmi-1蛋白显著低于

小 结

1.1,25(OH)2D3体外抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的增殖能力；

2.1,25(OH)2D3体外抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的迁移能力；

3.1,25(OH)2D3体外抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的侵袭能力；

5.1,25(OH)2D3抑制乳腺癌细胞诱导破骨细胞骨吸收；

二、活性维生素D经Bmi-1介导在抑制乳腺癌移植瘤生长和骨转移中的作用

为了进一步研究活性维生素D是否经Bmi-1介导在抑制乳腺癌移植瘤生长和骨转移中的作用，我们建立了Bm

1.Bmi-1表达下调通过上调P16、P19和P53表达抑制乳腺癌移植瘤生长

图9. Bmi-1表达下调通过上调P16、P19和P53表达以抑制乳腺癌移植瘤生长

为了明确Bmi-1下调是否能够抑制活性维生素D缺失引起的乳腺癌移植瘤生长加速，我们将空载体TM40D

3.Bmi-1下调抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D的体外增殖、迁移和侵袭能力

为明确Bmi-1下调对小鼠乳癌细胞TM40D增殖、迁移和侵袭能力的影响，我们分别采用CCK-8试验、

将TM40D阴性对照组（NC）、空载组（vector）、下调组（shBmi-1）96孔板培养24h、

图13. shBmi-1抑制小鼠乳腺癌细胞TM40D侵袭能力（200×）

将阴性对照组、空载组、Bmi-1下调组的TM40D细胞transwell培养36小时，行transw

4.Bmi-1下调抑制小鼠体内乳腺癌细胞产生的溶骨性骨破坏

为了评估Bmi-1下调对胫骨中TM40D肿瘤生长和肿瘤诱导的骨破坏的影响，我们使用前述的造模方法，将

5.外源性l,25(OH)2D3干预和Bmi-1下调均上调抑癌基因在骨转移灶内乳腺癌细胞中的表达

为了明确l,25(OH)2D3是否通过Bmi-1介导来激活抑癌基因，发挥抑制乳腺癌细胞生长的作用，我

图15. 外源性l,25(OH)2D3和Bmi-1下调均上调抑癌基因在乳腺癌细胞中的表达

小 结

2.1,25(OH)2D3缺乏通过上调Bmi-1在乳腺癌细胞中的表达，促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞衰老

4.Bmi-1表达下调抑制小鼠乳腺癌细胞产生的溶骨性骨破坏；

讨 论

参考文献

综述

致　谢