猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6、ORF5基因的克隆、核酸疫苗构建及鉴定

摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)主要引起母猪的繁殖障碍，给各国养猪业造成了巨大的经济损失。目前对PRRS的防治尚无切实有效的方法，主要采取疫苗免疫接种和综合防治相结合的方法。用于该病防制的疫苗主要是灭活苗和弱毒苗。但灭活苗主要引起体液免疫，而猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有抗体依赖性增强作用(ADE)，因此在PRRS防治上受到一定的限制。而弱毒苗主要是在安全方面存在一定的问题，例如在接种弱毒疫苗后造成经胎盘感染胎儿等，对繁殖性能造成不利影响，精液带毒和精液质量下降现象，还可能造成疫苗毒的传播，引起PRRSV的持续感染和病毒血症，有些猪群出现急性PRRS样综合症状。所以对弱毒疫苗在推广使用前必须进行大量全面的试验研究。因此对PRRS等免疫抑制性疾病的防制，常规疫苗不能起到较好的效果。由于核酸疫苗可同时诱导细胞免疫和体液免疫，可以对不同血清型的毒株产生交叉保护性，因此核酸疫苗有望成为重要研究方向。 本研究首先根据已发表的PRRSV国内分离株HB-1株的核苷酸序列，设计了引物，用RT-PCR的方法扩增了PRRSV长春分离株ORF6、ORF5两个重要的免疫原性基因，经凝胶电泳回收后克隆到pMD-18T载体上，经酶切鉴定后进行序列测定。序列分析表明PRRSV长春分离株与标准美洲株的核苷酸与氨基酸同源性较高，ORF6基因核苷酸序列的同源性达95.4％，ORF5基因核苷酸序列的同源性达89.6％：ORF6基因氨基酸序列的同源性达97.1％，ORF5基因氨基酸序列的同源性达89.1％。表明PRRSV长春分离株属于美洲型。 将ORF6基因克隆至真核表达载体pVAX1上，构建重组质粒pVAX1-ORF6。辅以超抗原SEA构建了含内源性佐剂的重组质粒pVAX1-SEA-ORF6，同时将ORF6、0RF5基因串联构建了重组质粒pVAX-SEA-ORF6-ORF5，将构建的三种重组质粒转染BHK-21细胞，通过IFA，RT-PCR检测方法表明，所构建的3个重组质粒能在真核细胞中进行有效的转录，并表达了目的蛋白(M)、 (GP5)。 综上所述，本试验成功构建了表达ORF6、ORF5基因的PRRS核酸疫苗。为新型PRRS疫苗的研究奠定了基础，并提供科学依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)概述

2 PRRSV的生物学特性

3 PRRSV的基因遗传变异性

4 PRRS的流行特点

5 PRRS的症状及病变

6 PRRSV免疫学特征

7 PRRS的临床诊断学研究

8 PRRS疫苗的研究进展

9本课题的研究目的及意义

材料

1菌株、质粒、细胞和病毒

2酶与试剂

3主要仪器

4各种溶液及培养基

方法

1.PRRSV ORF6、ORF5基因的克隆与序列分析

1.1 PRRSV ORF6、ORF5基因的克隆

1.2序列测定与分析

2.PRRSV DNA重组体的构建

2.1 DNA重组体PVAX1-ORF6构建

2.2 DNA重组体PVAX1-SEA-ORF6的构建

2.3DNA重组体PVAX1-SEA- ORF6-ORF5构建

3.PRRSV DNA重组体的鉴定

3.1 PRRSV DNA重组体的酶切鉴定

3.2 PRRSV DNA重组体转染细胞

3.3 PRRSV DNA重组体间接免疫荧光法(IFA)检测

3.4 PRRSV DNA重组体RT-PCR鉴定

结果

1 PRRSV ORF6、ORF5基因的克隆

1.1引物设计结果

1.2 RT-PCR

1.3重组质粒的鉴定

1.4核苷酸、氨基酸序列测定及其分析比较

2 PRRSV DNA重组体的酶切鉴定

2.1 DNA重组体PVAX1-ORF6的鉴定结果

2.2 DNA重组体PVAX1-SEA-ORF6的酶切鉴定结果

2.3 DNA重组体PVAX1-SEA-ORF6-ORF5的酶切鉴定结果

3 PRRSV DNA重组体的IFA检测结果

4 PRRSV DNA重组体的RT-PCR鉴定结果

讨论

结论

参考文献

致谢