猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因的克隆与PCR诊断方法的建立

摘要

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)在世界各地分布非常广泛，在畜禽中带菌率较高，有资料指出，猪的鼻道深处和喉头内，带菌率为30.9％。产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasturella multocida T Pm)能导致进行性萎缩性鼻炎。进行性萎缩性鼻炎被列为规模化养猪五大传染病之一，并被国际兽疫局(Office International Des Epizooties，OIE)定为B类动物传染病。我国因引种而带进本病，现已在我国许多省、市(区)有不同程度的发生和流行。 随着集约化程度的不断提高，该病对养猪业的危害也曰趋严重，我国猪传染性萎缩性鼻炎的发病率高达60％以上，已造成严重的经济损失。T<'+>Pm是进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis，PAR)的主要病原菌，检测、分离T<'+>Pm是诊断和控制该病的关键。基于产毒多杀性巴氏杆菌毒素(Pasteurella multocidatoxin，PMT)的特性，已经建立了一些实验方法，如豚鼠皮肤坏死实验、小鼠致死实验、细胞促生长实验、胎牛肺细胞毒性实验、ELISA等，来检测T<'+>Pm。但这些方法，无论是动物实验还是细胞培养都必须首先分离出T<'+>Pm。可见操作繁琐、费时、费力，临床上应用有很大的局限性，而PCR诊断方法具有特异、快速、敏感等优点，可以不进行T<'+>Pm的分离即可对产毒多杀性巴氏杆菌病进行诊断，简单、快捷、准确。 本试验根据GenBank上报道的产毒多杀性巴氏杆菌toxA的基因序列，选择其保守序列作为扩增区域。利用Oligo 6.0和Primet Premier 5.0软件设计筛选出适合的一对PCR引物，扩增片段为338bp，并成功的连接到pGEM-T Easy载体上，构建了含有产毒多杀性巴氏杆菌特异基因片断的重组质粒，经限制性内切酶Not Ⅰ酶切分析、PCR鉴定以及序列分析，验证所克隆的基因为产毒多杀性巴氏杆菌特异性基因，建立了产毒多杀性巴氏杆菌病的PCR诊断方法。测得的标准产毒多杀性巴氏杆菌特异基因序列与本地分离的产毒多杀性巴氏杆菌特异基因序列同源性为97.94％，特异性和敏感性试验结果表明，该诊断序列不能扩增出金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏杆菌、大肠杆菌、败血性波氏杆菌的DNA；当样本中产毒多杀性巴氏杆菌DNA含量为432.6fg/μl时，仍可扩增出清晰可辨的条带。利用PCR技术对55头份来自延边地区的鼻拭子样本进行检查，检出率为16.36％，所建立的PCR诊断方法具有特异、快速、敏感等优点，为产毒多杀性巴氏杆菌病的诊断提供了一种可靠的诊断方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1、产毒多杀性巴氏杆菌的概述

2、猪萎缩性鼻炎研究概况

3、猪进行性萎缩性鼻炎的检测方法的研究进展

4、研究目的和意义

1.试验材料

1.1试验病料

1.2对照病原体

1.3菌种与质粒

1.4试剂

1.5试验用溶液及其配制

1.6主要仪器设备

2.试验方法

2.1病料的采集

2.2野外菌株实验室常规分离与诊断

2.3引物的设计与合成

2.4 PCR反应

2.5PCR产物的纯化回收

2.6感受态细胞的制备

2.7重组连接反应

2.8重组连接后质粒DNA的转化

2.9克隆的筛选

2.10质粒DNA的小量制备——碱裂解法

2.11重组质粒的单酶切鉴定

2.12阳性质粒的PCR鉴定

2.13最适退火温度的筛选

2.14特异性试验

2.15敏感性试验

2.16区域性试验

3.序列测定及分析

3.1序列测定

3.2序列分析

3.3对比试验

4.试验结果

4.1PCR扩增

4.2退火温度筛选结果

4.3目的基因的克隆及重组质粒的鉴定

4.4序列测定及同源性分析

4.5特异性试验

4.6敏感性试验

4.7应用试验

4.8本地分离Pm的生化试验

4. 9实验室分型结果

5.讨论

6.结论

参考文献

致谢

作者简介

附录