CIK细胞对A549人肺癌细胞株的抗增殖和诱导凋亡作用的研究

摘要

目的:研究多种细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对A549肺癌细胞株的抗增殖和诱导凋亡作用，并探讨其作用机制。
　　方法：应用MTT法检测CIK细胞对肺癌细胞株的抗增殖作用的影响及细胞毒活性；通过倒置显微镜、透射电镜、AO/EB荧光染色观察凋亡细胞的形态学改变；应用末端脱氧核苷酸转移酶﹙TdT﹚介导的脱氧核苷酸缺口末端标记﹙TUNEL﹚法检测CIK细胞诱导凋亡的情况；通过免疫细胞化学染色法检测 A549细胞中凋亡相关基因 p53、Fas、caspase-3,caspase-8,caspase-9、survivin蛋白,细胞增殖相关蛋白 Ki-67的阳性表达率，以探讨其在诱导肺癌细胞凋亡中的作用。
　　结果：
　　(1)MTT比色法表明随着CIK细胞与肺癌细胞效靶比增加及作用时间延长，抑制率明显增强。同一作用时间不同效靶比之间有显著性差异，不同作用时间同一效靶比之间也有显著性差异；
　　(2)倒置显微镜观察：CIK细胞向靶细胞方向靠近，形成典型的玫瑰花环状改变。肿瘤细胞胞浆出现颗粒状物，有的CIK细胞游入肺癌细胞质或胞核内杀伤肿瘤细胞，肿瘤细胞数明显减少，对照组肺癌细胞生长良好；
　　(3)HE染色：CIK实验组同倒置显微镜下所见；
　　（4）透射电镜观察结果：在效靶细胞混合培养5小时和14小时后，多数靶细胞内可见到染色质浓缩，核仁分解，胞质内出现空泡，凋亡小体形成。在效靶细胞共育24小时后，绝大多数靶细胞死亡，死亡方式有细胞凋亡及溶解坏死两种；
　　（5）AO/EB荧光染色观察：实验组肿瘤细胞减少，凋亡细胞增多，细胞体积缩小，部分细胞核破裂；
　　（6）TUNEL法检测结果：效靶细胞混合培养后，起初随时间延长凋亡细胞逐渐增多，5－14小时凋亡率明显上升，14－24小时凋亡率下降；
　　（7）免疫细胞化学染色的结果表明：CIK实验组p53、Ki-67、survivin蛋白随作用时间的延长而均下降，Fas、caspase-3,caspase-8,caspase-9蛋白表达上调，与对照组相比较均有显著性差异。
　　结论：
　　1．CIK细胞对A549肺癌细胞具有抗增殖及诱导凋亡作用。
　　2．CIK细胞对A549肺癌细胞的抗增殖作用机制可能与下调Ki-67蛋白的表达，使癌细胞处于静止期有关。
　　3．CIK细胞对A549肺癌细胞的诱导凋亡作用机制可能与下调p53、survivin蛋白的表达,上调Fas、caspase-3,caspase-8,caspase-9蛋白的表达有关,经由细胞凋亡的死亡受体和线粒体通路完成凋亡的启动和执行。
　　4．CIK细胞是一种新型高效具有较强杀伤体外肺癌细胞的免疫活性细胞，有可能用于临床上晚期肺癌的过继性免疫治疗。

目录

声明

第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 药物及试剂

2.1.2 主要仪器

2.1.3 实验细胞

2.2 方法

2.2.1 体外细胞培养

2．2．2 检测A549肺癌细胞株存活率

2．2．3 效应细胞制备

2．2．4 MTT法体外细胞毒测定

2．2．5 细胞凋亡的形态学观察

2．2．6 TUNEL法检测细胞凋亡

2．2．7 免疫细胞化学染色

2．3 统计学处理

第三章 结 果

3.1 MTT法检测CIK细胞对A549肺癌细胞株的抗增殖作用

3.2 A549肺癌细胞的形态学改变

3.2.1 CIK细胞作用于A549肺癌细胞倒置显微镜观察

3．2．2 HE染色

3．2．3 透射电镜

3．2．4 AO/EB免疫荧光染色

3．3 TUNEL法检测CIK对肺癌细胞的诱导凋亡作用

3．4 免疫细胞化学法检测凋亡相关基因蛋白表达水平

附图

第四章 讨 论

4.1 CIK细胞对A549肺癌细胞株的抑制作用

4．2 CIK细胞诱导A549肺癌细胞株的凋亡作用

4．2．1 CIK细胞诱导A549肺癌细胞凋亡的形态学变化

4．2．2 A549肺癌细胞凋亡的生化学检测

4.3 CIK细胞诱导A549肺癌细胞株凋亡作用机制的探讨

4.3.1 p53基因

4.3.2 Survivin基因

4.3.3 Ki-67

4.3.4 Fas受体

4.3.5 Caspase-3,caspase-8,caspase-9

第五章 结论

致谢

参考文献

综述:CIK细胞的研究进展