共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白和猪瘟病毒E2蛋白的“自杀性”DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的GP5蛋白是PRRSV最重要的结构蛋白之一，可诱导机体产生中和抗体并具有很强的中和病毒活性，而且还可刺激机体产生细胞免疫，是研制新型疫苗的首选靶蛋白。
　　猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）E2囊膜糖蛋白是CSFV的主要结构蛋白之一，能诱导机体产生中和抗体和保护性免疫应答，因此，E2蛋白是开发猪瘟新型疫苗、诊断试剂及研究CSFV致病机理的重要靶蛋白。
　　“自杀性”DNA疫苗（suicidal DNA vaccine）是基于常规DNA疫苗和“自主复制型”RNA疫苗（self-replicating RNA vaccine）基础上发展起来的一种新型疫苗，不仅具有“自主复制型”RNA疫苗的安全性与高效性，而且结合了常规DNA疫苗制备简单、保存方便等优点，这使其成为目前核酸疫苗研究的热点。
　　为了获得新型双价“自杀性”DNA疫苗，将PRRSV GP5基因克隆于此前构建的表达CSFV E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中。为了增强免疫效果，在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位（PADRE），在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒（PrV）UL49基因，获得了6种重组质粒。间接免疫荧光试验显示，PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达。将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠，用间接ELISA方法检测血清抗体水平，通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫。结果显示，除pSFV1CS组外，从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体；各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能发生特异性的淋巴细胞增殖；部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4；引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组。
　　这表明，这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫，PrV UL49可以增强其细胞免疫应答。

目录

声明

引言

1.1猪繁殖与呼吸综合征研究进展

1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述

1.1.2 猪繁殖与呼吸综合征流行病学特点

1.1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒

1.1.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白

1.1.5 猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究进展

1.2 猪瘟研究进展

1.2.1 猪瘟概述

1.2.2 猪瘟病毒

1.2.3 猪瘟病毒的主要编码蛋白及其功能

1.2.4 猪瘟疫苗研究进展

1.3 “自杀性”DNA疫苗的简介

1.3.1 甲病毒复制子RNA疫苗

1.3.2 甲病毒复制子概念

1.3.3 甲病毒复制子的“自主复制型”RNA疫苗的基本原理

1.3.4 “自杀性”DNA疫苗的产生及应用

1.4 VP22和泛DR表位简介

1.5 本研究目的意义

材 料 与 方 法

1 材 料

1.1 毒株、细胞与菌种

1.2 载体与质粒

1.3 单克隆抗体和重组蛋白

1.4 工具酶与试剂

1.5 主要试验仪器

1.6 试验动物

2.1 PRRSV GP5基因的PCR扩增和克隆

2.2 重组质粒构建

2.3 重组质粒鉴定

2.4 重组质粒在293T细胞中的瞬时表达

2.5 重组质粒的大量提取

2.6 动物分组及DNA免疫接种

2.7 免疫小鼠血清中特异性抗体的测定

2.8 用WST-8试剂检测小鼠脾淋巴细胞增殖

2.9 用CFSE染色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖

2.10 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ和IL-4水平的ELISA检测

结果

1 目的基因的PCR扩增

2 重组质粒的酶切鉴定

3 外源基因在瞬时转染细胞中的表达

4 免疫小鼠血清特异性抗体的检测

5 免疫小鼠的特异性淋巴细胞增殖水平

6 免疫小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4水平

讨论

结论

参考文献

致谢