羊泰勒虫病PCR诊断方法的建立及初步应用

摘要

羊泰勒虫是一类寄生于羊血液细胞的泰勒科泰勒属的血液原虫，由其引起的疾病总称羊泰勒虫病（Ovine and caprine theileriosis）。羊泰勒虫病危害严重，可引起羔羊和外地引进羊大量死亡，使慢性发病的山羊和绵羊生长发育变缓，产肉量和产毛量显著下降，从而给养羊业造成巨大经济损失。传统的诊断方法主要有血液涂片染色镜检、间接荧光抗体试验、间接酶联免疫吸附试验等，但这些方法均有不同程度的缺点。因此有必要建立一种快速、敏感、特异诊断方法，以便进行羊泰勒虫病的早期诊断和预防。
　　本研究根据GenBank中报道的羊泰勒虫18S rRNA和表面蛋白基因序列，利用Oligo6.0和Primer Premier5.0软件分别设计了两对特异性引物，扩增出长为671bp和610bp两条特异性基因片断，并分别克隆到pGEM-T Easy载体上，经酶切分析、PCR鉴定后，筛选阳性克隆的重组质粒进行核苷酸序列分析及同源性比较。结果表明，测得的羊泰勒虫吉林分离株18S rRNA基因序列与羊泰勒虫基因序列China1（AY492086）、China2（AY262121）同源性分别为100％和96.0%，与国外报道的绵羊泰勒虫（AY260172）同源性为97.0%，与山羊泰勒虫（AF081135）同源性为96.4%；测得的羊泰勒虫吉林分离株表面蛋白基因与羊泰勒虫表面蛋白China1的同源性为99.5%。
　　在以上研究内容的基础上，建立了检测羊泰勒虫18S rRNA基因和表面蛋白基因的两种常规PCR诊断方法和一种检测羊泰勒虫18S rRNA基因半套式PCR诊断方法。并通过平行检测51份羊血液样本，对3种PCR方法进行了比较，结果表明半套式PCR方法阳性检出率优于两种常规PCR方法。
　　本研究建立的半套式PCR方法可检测到0.016fg的质粒 DNA含量，比常规PCR方法敏感100倍。所建立的半套式PCR具有敏感性高、特异性强、稳定性好等特点，完全实用于羊泰勒虫病的早期诊断及疫情检测。
　　应用所建立的半套式PCR方法对吉林省珲春地区的130头份血液样本进行检测，并与血液涂片染色镜检进行了比较。结果表明，半套式PCR方法的阳性检出率为35.38%，而血液涂片染色镜检阳性率仅为15.38%。

目录

声明

引言

1 羊泰勒虫病

2 羊泰勒虫病原学研究进展

3 羊泰勒虫病的分布和危害

4 羊泰勒虫病诊断技术的研究进展

5 羊泰勒虫病防治研究进展

6 本研究的目的和意义

1 材 料

2 方 法

结果

1 血液涂片结果

2 不同方法提取总DNA结果

3 PCR扩增结果

4 目的基因的克隆

5 重组质粒的鉴定

6 序列测定及分析

7 常规PCR诊断方法的建立

8 半套式PCR诊断方法的建立

9 不同PCR方法对羊泰勒虫检测结果的比较

10 应用半套式PCR方法对吉林省珲春地区羊泰勒虫病流行情况初步调查

讨论

1 羊泰勒虫吉林分离株18S rRNA基因序列分析

2 羊泰勒虫吉林分离株表面蛋白基因序列分析

3 血液中DNA提取方法对虫体基因组DNA质量的影响

4 羊泰勒虫病两种常规PCR诊断方法的建立

5 羊泰勒虫病半套式PCR诊断方法的建立

6 不同PCR方法对羊泰勒虫检测结果的比较

7 应用半套式PCR方法对吉林省珲春地区羊泰勒虫病流行情况初步调查

结论

参考文献

致谢

作者简介

附 录（攻读学位期间发表论文目录）