优化获能和冷冻稀释液及其对猪精子肌动蛋白表达影响的研究

摘要

本试验的主要目的为优化获能和冷冻稀释液及其对猪精子肌动蛋白表达影响的研究。采用玻璃化冷冻法，将0.1 mol/L海藻糖、蔗糖和乳糖分别添加到冷冻稀释液中，筛选最适合猪精液的冷冻保护剂；将猪精子置于 mTBM和 TALP两种获能液中分别孵化2h、3h、4h、5h和6h，筛选最适合猪精子的获能体系；用最适的冻融和获能方法进行SDS-PAGE和Western免疫印迹分析。结果表明：
　　1、预处理时以500 r/min离心10 min，0.1 mol/L海藻糖和蔗糖组与对照组和0.1 mol/L乳糖TCG组相比，能显著改善冻融后猪精子质量（P<0.05），其冻融后精子的活率为42.1％和40.6％，顶体完整率为51.5％和49.8％，低渗膨胀率为46.2％和43.0％，平均路径速度为32.8μm/s和33.2μm/s，运动的线速度为60.8％和59.0％，平均侧摆幅度为1.7μm和1.6μm，平均鞭打频率为7.7 Hz和7.6 Hz；其体外受精力也明显高于0.1 mol/L乳糖和对照组（P<0.05），其卵裂率分别为41.2％和38％。
　　2、鲜精在mTBM和TALP两种获能液中获能时，随着获能时间的延长，猪精子顶体反应率逐渐升高、质膜完整性逐渐下降，获能6h时的顶体反应率明显高于其他时间组（P<0.05），分别为52.5％和50.8％；质膜完整性明显低于其他时间组（P<0.05），分别为30.5％和31.4％；获能4 h的超激活运动率明显高于其他时间组（P<0.05），分别为56.6％和54.5％。将鲜精与冻融的精子获能4 h后与成熟的猪卵母细胞进行体外受精，mTBM处理组的卵裂率明显高于TALP（P<0.05），分别为42.7％与40.2％和35.9％与33.4％，但鲜精与冻融精液组间差异不显著。
　　3、新鲜和冻融的猪精子细胞肌动蛋白单体的分子量约为43KD，但冻融的猪精子细胞肌动蛋白单体的含量略低于鲜精的；获能的猪精子细胞肌动蛋白单体的分子量约为43KD和86KD。

目录

声明

第一章 前 言

1.1精子的细胞骨架蛋白

1.1.1精子细胞骨架的作用

1.1.2精子细胞骨架蛋白的测定

1.2精子的体外获能

1.2.1精子获能的原理

1.2.2精子体外获能的影响因素

1.3精液的冷冻保存

1.3.1精液冷冻保存的机理

1.3.2影响冻融精子质量的因素

1.4精子质量评估方法

1.4.1 精液品质评估的终定标准

1.4.2 精子运动能力

1.4.3 精子活率

1.4.4 精子质膜完整性

1.4.5 精子顶体完整性

1.4.6 精子线粒体活性

1.4.7 精子获能与Ca2+内流

1.4.8 精子受精能力检测

1.5 本试验研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 时间和地点

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要药品

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1.药品的配制

2.2.2 实验内容

2.2.3统计分析

第三章 结果与分析

3.1 双糖对冻融猪精液质量参数的影响

3.1.1 不同离心速度对猪精液质量参数的影响

3.1.2双糖对冻融后精子运动参数的影响

3.1.3双糖对体外受精的影响

3.2不同获能条件对猪精子体外获能的影响

3.2.1不同获能液和不同获能时间对体外获能的精子影响

3.2.2不同获能液对体外受精的影响

3.3获能、顶体反应和冻融的精子肌动蛋白的表达

3.3.1 SDS-PAGE电泳分析

3.3.2 Western免疫印迹分析

第四章 讨 论

4.1 冷冻－解冻过程中双糖对猪精子的保护作用

4.2不同获能条件对精子体外获能的影响

4.3 获能、顶体反应和冻融精子肌动蛋白的变化

第五章 结 论

参考文献

致谢