联合抑制sorcin和mdr1基因逆转K562/A02细胞株多药耐药性

摘要

目的：探讨联合抑制可溶性耐药相关钙结合蛋白基因（sorcin）和多药耐药相关蛋白基因（mdr1）对K562/AO2细胞株多药耐药性的影响。
　　方法：使用针对sorcin和mdr1基因特异的反义寡核苷酸（ASODN），运用脂质体转染技术将其导入K562/A02细胞后，通过实时定量RT-PCR、Western Blot及流式细胞仪分析方法检测细胞内sorcin和mdr1基因在mRNA和蛋白表达水平的变化，运用MTT方法检测转染后细胞对阿霉素及其他化疗药物敏感性的变化，运用流式细胞仪检测转染后细胞对罗丹明123外排功能的变化及Annexin-V/PI双染法检测转染后细胞对VP16诱导凋亡耐受的变化。
　　结果：将针对sorcin和mdr1基因特异的反义寡核苷酸（ASODN），通过脂质体转染至K562/A02细胞后，sorcin和mdr1在 mRNA和蛋白水平表达较未转染细胞相比明显下调；单独转染sorcin-ASODN或mdr1-ASODN细胞对ADR、VCR、VP-16及 HHT的敏感性较未转染细胞相比显著提高，共转染sorcin-ASODN和mdr1-ASODN细胞对化疗药物的敏感性较单独转染细胞相比显著提高；单独转染mdr1-ASODN细胞药物外排功能较未转染细胞相比显著下降，单独转染sorcin-ASODN细胞药物外排功能较未转染细胞相比无差异，双转染 sorcin-ASODN和 mdr1-ASODN细胞药物外排功能较单独转染mdr1-ASODN细胞相比无显著性差异；单独转染mdr1-ASODN或sorcin-ASODN细胞对 VP-16诱导凋亡耐受性较未转染细胞相比显著下降，双转染sorcin-ASODN和 mdr1-ASODN细胞对 VP-16诱导凋亡耐受性较单独转染mdr1-ASODN或sorcin-ASODN细胞相比有显著性差异。
　　结论：
　　①本研究中使用针对sorcin和mdr1特异的ASODN,通过脂质体转染方法，能够成功下调K562/A02细胞株中sorcin和mdr1基因在mRNA和蛋白水平上的表达。
　　②单独抑制sorcin或mdr1可以有效恢复K562/A02细胞对化疗药物的敏感性，但同时抑制两者的表达，能更显著恢复对化疗药物的敏感性。
　　③单独抑制sorcin并不能影响K562/A02细胞内化疗药物的蓄积，但可引起细胞对化疗药物诱导凋亡耐受性的下降；同时抑制sorcin和mdr1的表达较单独抑制mdr1的表达，胞内药物的含量也没有显著性差异，但化疗药物诱导凋亡耐受性显著低于单独抑制sorcin或mdr1的表达。
　　④sorcin和mdr1代表了两种独立的机制赋予K562/A02的耐药性，一方面确证了多药耐药细胞中多因素耐药机制共存的现象，而另一方面证实了联合sorcin和mdr1可以作为逆转耐药的有效治疗靶点。

目录

声明

第一章 前 言

第二章 实验材料与方法

2.1实验材料和仪器

2.1.1药物及试剂

2.1.2 实验对象

2.1.3 主要仪器

2.2 试验方法

2.2.1 反义寡核苷酸转染[18]

2.2.2实时定量RT-PCR方法检测ASODN转染后K562/A02细胞内sorcin和mdr1的mRNA表达的变化

2.2.3 Western blotting方法检测ASODN转染后K562/A02细胞内sorcin蛋白表达水平

2.2.4 流式细胞仪（FCM）分析法检测mdr1-ASODN转染后K562/A02细胞内Pgp表达的变化

2.2.5 细胞对化疗药物敏感性的测定

2.2.6 细胞外排泵功能的测定

2.2.7 细胞对VP-16诱导凋亡的影响

2.2.8 统计学处理

第三章 结果

3.1 实时定量RT-PCR方法检测ASODN转染后K562/A02细胞内sorcin和mdr1的mRNA表达的变化

3.2 流式细胞仪分析法检测mdr1-ASODN转染后K562/A02细胞内pgp表达的变化

3.3 Western blotting方法检测ASODN转染后K562/A02细胞内sorcin表达的变化

3.4 MTT方法检测细胞半数抑制率

3.5 流式细胞仪检测细胞外排泵功能

3.6 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞早期凋亡率

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

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