不同处理对猪精子蛋白磷酸化的位点分布、水平的影响

摘要

本研究的主要目的是评价获能、冷冻、处理时间对精子蛋白酪氨酸磷酸化位点分布与表达以及质量的影响。本次试验主要使用了姬姆萨染色法染色、考马斯亮蓝染液染色、免疫荧光、SDS-PAGE和 Western免疫印迹分析等方法分别检测了精子活力、顶体完整率、蛋白酪氨酸磷酸化位点分布与表达。试验主要分为:Ⅰ采用不同的冷冻方法、不同的解冻温度以及孵育的不同时间来检测精子的质量；Ⅱ检测猪精子置于 mTBM溶液中获能处理时间(0、0.5、1、1.5及2 h)对猪精子获能效率的影响；Ⅲ将获能处理不同时间的精子进行间接免疫荧光处理，荧光显微镜下显示精子蛋白酪氨酸磷酸化位点的变化；Ⅳ将获能处理不同时间的精子进行SDS-PAGE和 Western免疫印迹分析。
　　试验结果如下：
　　1、快速冷冻法和慢速冷冻法之间的冷冻效果差异不显著（P＞0.05），使用0.5 ml细管冷冻时，慢速冷冻和快速冷冻法之间的冷冻效果差异显著（P<0.05）。慢速冷冻法时，使用0.25 ml和0.5 ml细管冷冻，解冻后精子活力、顶体完整率差异不显著（P＞0.05）；快速冷冻时，使用0.25 ml和0.5 ml细管冷冻，解冻后精子活力、顶体完整率差异显著（P<0.05），0.25 ml细管优于0.5 ml细管；在40℃和45℃水浴中解冻，解冻后精子活力、顶体完整率差异不显著（P＞0.05），但均优于35℃水浴中解冻，并且差异显著（P<0.05）。使用0.25ml细管冷冻时，解冻温度40℃优于45℃，二者之间差异显著（P<0.05）。解冻温度相同时，使用0.25 ml和0.5 ml细管冷冻时，解冻后精子活力差异显著（P<0.05），0.25 ml细管优于0.5 ml细管；解冻后孵育20 min、30 min和40 min精子活力、顶体完整率差异显著（P<0.05），30 min最好，孵育40 min后精子活力、顶体完整率显著下降（P<0.05）。
　　2、获能时间增加，精子活率降低，获能时间为2h组与其他组之间差异显著(P<0.05)。获能时间对精子质膜完整性的影响较大，随着获能的进行，精子质膜完整率降低。
　　3、获能处理对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化水平变化影响明显；未经处理的精子仅在精子颈部可见略淡的酪氨酸磷酸化位点。而经过处理的精子蛋白酪氨酸磷酸化程度加深，荧光显色明显，在精子顶体部和尾部均可见明显的酪氨酸磷酸化位点。随着获能处理时间的延长，精子顶体部与尾部荧光显色越来越明显，证明获能处理能够引起精子内部酪氨酸磷酸化蛋白发生磷酸化。获能处理1 h和1.5 h时，精子蛋白酪氨酸磷酸化位点集中在顶体部和尾部。
　　4、随着获能时间的增加，精子出现了一些新的磷酸化蛋白位点，而在2 h时有部分蛋白位点丢失；猪精子体外获能孵育0至0.5 h,Western blot仅检测到一种分子量为27 ku的酪氨酸磷酸化蛋白,且这种蛋白的酪氨酸磷酸化水平随着获能的进行呈递增趋势。体外孵育1 h,检测到另一种47 ku的酪氨酸磷酸化蛋白,此蛋白酪氨酸磷酸化水平在体外获能孵育1.5 h达到最高峰,后随获能的进行呈递减趋势。

目录

声明

第一章 前言

1.1 精液的冷冻保存

1.1.1猪精液冷冻研究概况

1.1.2 猪精液冷冻保存机理

1.1.3 影响冻融精子质量的因素

1.2 精液质量评估方法

1.3 精子体外获能

1.3.1 精子获能原理

1.3.2 精子体外获能的影响因素

1.3.3 精子获能的评价

1.4 精子的酪氨酸磷酸化蛋白

1.4.1 酪氨酸磷酸化蛋白在精子上的分布

1.4.2酪氨酸磷酸化与精子获能

1.4.3精子酪氨酸磷酸化蛋白的定位

1.4.4精子酪氨酸磷酸化蛋白的表达

1.5本文研究目的及意义

第二章 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 时间和地点

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要药品

2.1.4 主要仪器

2.2 试验方法

2.2.2 实验内容

2.2.3统计分析

第三章 结果与分析

3.1冷冻解冻方法对冷冻后精子质量的影响

3.1.1 不同冷冻方法对冷冻后精子质量的影响

3.1.2不同解冻温度对冷冻后精子质量的影响

3.1.3解冻后孵育时间对冷冻后精子质量的影响

3.2获能处理对精子质量参数的影响

3.3获能过程中酪氨酸磷酸化蛋白的分布与表达

3.3.1获能过程中酪氨酸磷酸化蛋白的分布

3.3.2获能过程中蛋白酪氨酸磷酸化的水平

第四章 讨 论

4.1冷冻解冻方法对冷冻后精子质量的影响

4.1.1不同冷冻方法对冷冻后精子活力的影响

4.1.2不同解冻温度对冷冻后精子活力的影响

4.1.3解冻后孵育时间对冷冻后精子活力的影响

4.2获能处理对酪氨酸磷酸化蛋白的分布的影响

4.3获能处理对酪氨酸磷酸化蛋白的水平的影响

第五章 结 论

参考文献

附录一

致谢