笃斯越桔浆果提取物对小鼠H22肝癌腹水移植瘤抑制作用的实验研究

摘要

目的：观察笃斯越桔浆果提取物对小鼠H22移植型肝癌增殖的抑制作用，并检测荷瘤小鼠血清IL-2,TNF-α及细胞凋亡相关蛋白Cyclin E和p27kip1的表达以研究其作用机制。
　　方法：建立小鼠H22肝癌腹水移植瘤模型。将60只体重18-22g雄性昆明小鼠随机分成空白对照组、5-氟尿嘧啶对照组、模型组、笃斯越桔高、中、低剂量组,每组10只，除空白组外其他各组均为H22荷瘤小鼠。连续给药10天，观察笃斯越桔提取物对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用和小鼠体重变化。最后一次给药后，禁食不禁水24h后，称重并眼球取血。脱颈处死小鼠，获得瘤体、脾、胸腺并称重，计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。ELISA检测血清中IL-2和TNF-α含量，DNA Ladder琼脂糖电泳检测细胞凋亡，western blot检测肿瘤细胞中Cyclin E、p27kip1蛋白表达。
　　结果：
　　1.建立了小鼠H22肝癌腹水移植瘤模型。
　　2.笃斯越桔高、中、低剂量组，5-氟组、模型组瘤重分别为0.4134±0.14g、0.6106±0.18g、0.6832±0.42g、0.3565±0.11g、1.3736±0.59g,笃斯越桔高、中剂量组、5-氟组平均瘤重显著低于模型组(P＜0.05)，5-氟组、笃斯越桔高、中剂量组对H22移植瘤抑制率分别为74.1％、69.9%、55.6%。笃斯越桔浆果提取物高、中、低剂量组、5-氟组、模型组用药前后体重变化分别为8.2±1.9g、7.7±3.1g、8.4±2.2g、7.9±2.6g、8.6±2.7g，各组之间无显著性差异（P＞0.05)。笃斯越桔浆果提取物高、中、低剂量组、5-氟组、模型组各组胸腺指数分别为1.42±0.07、0.875±0.16、0.922±0.08、0.787±0.11、0.874±0.09，笃斯越桔高剂量组显著高于模型组(P＜0.05)，5-氟组与模型组无显著性差异(P＞0.05)；脾指数分别为15.68±0.57、9.94±0.81、9.64±0.75、8.91±0.87、9.71±0.38，笃斯越桔高剂量组显著高于模型组（P＜0.05)，5-氟组与模型组无显著性差异(P＞0.05)。
　　3.将 H22肿瘤组织提取DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳发现笃斯越桔高剂量组出现明显DNA Ladder现象，5-氟组和肿瘤组没有出现DNA Ladder现象。
　　4.将 H22肿瘤组织提取细胞总蛋白，进行western blot分析。5-氟组、笃斯越桔浆果提取物高、中、低剂量组、模型组细胞中，Cyclin E与β-actin相比相对含量分别为0.3567±0.0092、0.6110±0.0284、0.5668±0.0285、0.3184±0.0047、0.5830±0.0451，5-氟组和笃斯越桔高剂量Cyclin E表达量与模型组相比有显著性降低(P＜0.05)；p27kip1与β-actin相比的相对含量分别为0.4781±0.0081、0.7113±0.0160、0.4344±0.0123、0.2297±0.0188、0.2343±0.0029，笃斯越桔高中p27kip1表达量与模型组相比显著性升高（P＜0.05)，笃斯越桔中、低剂量组、5-氟组与模型组相比无显著性差异（P＞0.05）。
　　5.ELISA检测得到空白组、笃斯越桔浆果提取物高、中、低剂量组、5-氟组、模型组小鼠血清 IL-2水平分别为7.18±0.38ng/ml、3.63±2.07 ng/ml、5.73±1.48 ng/ml、6.03±1.56 ng/ml、5.68±1.7 ng/ml2、5.73±2.07 ng/ml，模型组和5-氟组血清IL-2含量显著低于空白组（P＜0.05)，笃斯越桔高、中、低剂量组血清IL-2含量，分别与5-氟组、模型组、空白组比较均没有显著性差异(P＞0.05)。
　　6. ELISA法检测空白组，5-氟组、笃斯越桔浆果提取物高、中、低剂量组、模型组小鼠血清TNF-α含量分别为1.33±0.87 ng/ml、2.03±1.41 ng/ml、1.83±1.08 ng/ml、2.43±1.08 ng/ml、2.63±1.24 ng/ml、2.53±0.66 ng/ml，各组与空白组相比，血清TNF-α含量无显著性差异（P＞0.05)。笃斯越桔高、中、低剂量组、5-氟组血清 TNF-α含量与模型组无显著性差异(P＞0.05)，笃斯越桔高、中、低剂量组与5-氟组血清TNF-α无显著性差异(P＞0.05)。
　　结论：笃斯越桔浆果提取物对小鼠 H22肝癌有抑制作用，并能提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数；能够诱导 H22肝癌肿瘤细胞发生细胞凋亡，可能通过诱导下调cyclin E水平，上调p27kip1水平发挥作用；笃斯越桔浆果提取物没有显著改变荷瘤小鼠血清IL-2和TNF-α水平。

目录

声明

缩略语表

第一章 前 言

第二章 实验材料

2.1 主要实验材料

2.2 实验试剂

2.3 实验耗材和仪器

2.4溶液的配制

第三章 实验方法

3.1小鼠H22肝癌腹水移植瘤模型的建立

3.2 笃斯越桔浆果提取物对小鼠H22肝癌的体内抗肿瘤实验

3.3笃斯越桔浆果提取物诱导小鼠H22肝癌细胞凋亡的检测

3.4小鼠H22肝癌瘤组织细胞Cyclin E、CDK2、P27kip1表达水平的westernblotting检测。

3.5 小鼠血清IL-2水平的ELISA检测

3.6 小鼠血清TNF-α水平检测

3.7统计学处理

第四章实验结果

4.1 小鼠H22肝癌腹水移植瘤模型建立结果

4.2 笃斯越桔浆果提取物对H22荷瘤小鼠肿瘤抑制作用结果

4.3笃斯越桔浆果提取物诱导小鼠H22肝癌细胞凋亡的检测结果

4.4 Cyclin E , p27kip1的westernblot检测结果

4.5 血清IL-2、TNF-α检测结果

第五章讨 论

5.1实验动物模型的选择和建立[17~19]

5.2笃斯越桔浆果提取物对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用

5.3 DNA Ladder琼脂糖电泳检测细胞凋亡

5.4 cyclin E ，p27kip1的westernblot检测

5.5血清 IL-2和TNF-α的ELISA检测

第六章结 论

参考文献

致谢

综述:Cyclin E、CDK2、P27kip1、细胞周期调控与肝癌