同时检测三种虫媒病毒的一步三重RT-PCR酶联杂交方法建立

摘要

虫媒病毒属于一组由媒介昆虫携带，通过敏感脊椎动物被叮咬从而得到传播的病毒。虫媒病毒可以引发多种人畜共患病，给我国公共卫生和家畜养殖业带来严重威胁和经济损失。人感染虫媒病毒后会表现出多种临床症状，其中以出疹和发热最常见，病情严重者还会产生如脑炎、脑膜炎等症状危及中枢神经系统，甚至死亡。目前，尚没有特效药物治疗虫媒病毒病，主要以注射疫苗来对虫媒病毒病进行预防。因此，尽量避免虫媒病毒的爆发和流行并加强对虫媒病毒进行检测显得的十分重要。目前，在我国对大多数虫媒病毒的检测，仍然通过传统血清学抗体检测和细胞培养分离病毒来进行诊断。尽管这些方法被誉为“金标准”，可以对虫媒病毒进行确诊，但敏感性较低，操作周期较长如细胞培养需要一周左右的时间，并且标本消耗较大，难以适应临床和现场诊断的要求。
　　本实验构建了多重RT-PCR联合酶联杂交技术，应用该技术可以通过一次扩增同时完成对三种虫媒病毒（乙脑病毒，盖塔病毒和塔希那病毒）的检测。它的主要内容为，首先比对 Genbank发表的和本实验室测定的已知三种病毒基因序列，在序列高度保守区内设计并合成含有5＇端生物素的引物和辣根过氧化物酶（HRP）标记的种特异性探针。然后，采用One-Step RT-PCR Kit（QIAGEN）进行一步法RT-PCR,通过种特异性探针识别病原PCR产物，加入HRP底物，通过显色鉴定病原。本研究建立的多重 RT-PCR酶联杂交方法检测敏感性为JEV:1PFU/mL，GETV:10PFU/mL，TAHV:10PFU/mL。将此方法应用于检测29份普通单重RT-PCR检测结果为乙脑阳性的脑脊液（CSF）标本,结果显示乙脑强阳性（OD值明显高于所设cutoff值），而其它两种病原（GETV和TAHV）均为阴性（OD值明显低于所设cutoff值）。本实验成功建立了能同时检测的三种虫媒病毒(JEV,GETV和TAHV)的多重RT-PCR酶联杂交方法,该方法具有良好的敏感性,并在检测临床标本中表现出良好特异性。

目录

声明

前言

1虫媒病毒概述

2虫媒病毒与虫媒病毒病

3概述乙脑病毒，盖塔病毒和塔希那病毒

4 虫媒病毒病的症状及治疗

5 传统虫媒病毒诊断技术

6新型分子诊断技术

7本研究的技术核心

8开展本研究的目的和意义

材料与方法

1材料

2方法

结果

1 引物与探针的设计

2 细胞培养和病毒扩增

3三种病毒滴度测定

4 验证引物特异性

5 单重RT-PCR测定JEV检测极限

6 多重RT-PCR测定JEV检测极限

7一步法三重RT-PCR酶联杂交方法的建立及其敏感性分析

8三种病毒PCR产物与种特异性探针交叉反应验证

9临床标本检测

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

附 录 A

附 录 B