猪肺泡巨噬细胞(PAM)极化模型的建立及PRRSV感染过程中动态变化研究

摘要

为了建立猪肺泡巨噬细胞（PAMs）不同亚型及研究不同亚型与 PRRSV之间的关系，本试验在体外通过IFN-γ/LPS诱导PAMs分化成M1型巨噬细胞，通过IL-4诱导分化成M2型巨噬细胞。通过Calcein-AM染色和电镜观察不同组细胞形态学变化。通过M1型巨噬细胞相关标志分子NO、IL-12鉴定M1型巨噬细胞诱导分化成功，通过M2型巨噬细胞相关标志分子Arg-1、IL-10鉴定M2型巨噬细胞诱导分化成功。正常的PAMs感染PRRSV后，测定M1、M2相关性分子的表达量，拟研究PAMs感染PRRSV后极化类型。体外成功刺激M1和M2不同亚型的PAMs与PRRSV共培养，通过测定M1、M2相关性分子，拟研究PRRSV对M1和M2两种亚型PAMs的影响。
　　为了检测NO的表达量，不同组细胞24h后提取上清，Griess法检测各组NO表达量显示，IFN-γ/LPS刺激的PAMs组相比较未刺激组和IL-4刺激组高表达，显示出极显著差异(P<0.01)。不同组细胞培养刺激24～72h，48h提取蛋白，Western结果显示，IL-4刺激的PAMs组相比较IFN-γ/LPS刺激组和未刺激组高表达,M2型巨噬细胞的标志性分子Arg-1显示出极显著差异（P<0.01）。同时，IFN-γ/LPS刺激的PAMs组相比较IL-4刺激组和未刺激组,M1型巨噬细胞相关性分子IL-12表现出极显著差异（P<0.01），IL-4刺激组相对于IFN-γ/LPS刺激组和未刺激组,M2型巨噬细胞相关性分子IL-10表现出极显著差异（P<0.01）。通过M1型相关标志分子NO、IL-12，M2型相关标志分子Arg-1、IL-10四种细胞因子的差异性表达，提示我们在体外成功诱导了M1型和M2型猪肺泡巨噬细胞。
　　为探究PAMs感染PRRSV后极化类型，分别设置了100TCID50、500TCID50、1000TCID50、5000TCID50不同病毒滴度的PRRSV组感染PAMs，按照上述的方法检测NO、Arg-1、IL-12、IL-10的表达量。测定结果显示，不同剂量的PRRSV感染PAMs后，M2型巨噬细胞相关分子Arg-1、IL-10表达量高，表现出显著（P<0.05）或极显著差异（P<0.01），M1型巨噬细胞相关分子NO、IL-12表达量略微上调，提示我们PAMs体外感染PRRSV后，PAMs向M2型极化。
　　为探究PRRSV对M1和M2两种亚型PAMs的影响，首先，将PAMs体外诱导分化成M1和M2两种亚型的巨噬细胞，两种亚型PAMs感染PRRSV后培养12-72h，用Griess法检测NO含量的变化，Western检测Arg-1、IL-10、IL-12细胞因子表达量的变化。结果显示，M1型PAMs感染PRRSV后会向M2型巨噬细胞转化，M2型PAMs感染PRRSV后变化不大。
　　结论：利用IFN-γ/LPS体外刺激PAMs成功诱导M1型巨噬细胞，利用IL-4成功诱导M2型PAMs。PAMs体外感染PRRSV后，PAMs向M2型极化。M1型PAMs感染PRRSV后会向M2型巨噬细胞转化，M2型PAMs感染PRRSV后变化不大。

目录

声明

前言

1 猪繁殖与呼吸综合征概述

2 PRRSV概述

3 巨噬细胞概述

4.巨噬细胞亚型研究现状

5 PRRSV与猪肺泡巨噬细胞之间的关系

6本试验研究的目的和意义

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 PAMs纯度鉴定

2 M1和M2两种亚型PAMs模型的建立

3 PAMs感染PRRSV前后形态变化

4 PAMs感染PRRSV后极化类型试验结果

5 PRRSV对M1和M2两种亚型的PAMs影响研究

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

附录