弓形虫SAG1和GRA4基因的原核表达及其重组猫疱疹病毒Ⅰ型转移载体的构建

摘要

弓形虫病（Toxoplasmosis）是由专性细胞内刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）寄生于人和多种动物而引起的一种人兽共患病。它不仅给畜牧业带来了巨大的经济损失，同时造成孕妇的流产、死产等，可垂直传播给胎儿，致使胎儿的先天性疾病；也是造成艾滋病、恶性肿瘤等免疫缺陷患者死亡的重要病因。猫是弓形虫的终末宿主，因此针对猫弓形虫病疫苗的研发显得尤为重要。以病毒为载体的疫苗得到了良好的免疫效果，猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline Herpesvirus type l，FHV-l)是一个很好的疫苗候选载体，TK基因是疱疹病毒增殖的非必需基因和主要的毒力基因，允许大容量的外源基因插入和表达。
　　应用 RT-PCR方法扩增弓形虫 RH株 SAG1和 GRA4基因，构建了pMD-18T-SAG1/GRA4克隆载体、pColdⅢ-SAG1/GRA4原核表达载体、pBluescipt-TK转移载体及重组猫疱疹病毒穿梭质粒 pBS-TK-SAG1/GRA4；将pColdⅢ-SAG1/GRA4原核表达载体转化至E.coli BL21感受态细胞，IPTG诱导，SDS-PAGE和 Western-blot分析表达产物，并应用弗氏佐剂制备 TgSAG1/GRA4蛋白亚单位疫苗，接种 BALB/c小鼠制备抗 rTgSAG1/GRA4蛋白的血清；利用脂质体介导转染法将 pBS-TK-SAG1/GRA4重组质粒转染293T细胞，应用间接免疫荧光检测方法(IFAT)和 Western blot技术检测基因 TgSAG1/GRA4在293T细胞中的表达。结果显示，扩增的弓形虫 RH株 SAG1和 GRA4基因长度分别为960 bp和1038 bp，成功构建了原核表达重组质粒 pColdⅢ-SAG1/GRA4，表达的重组蛋白分子量依次为52 ku、57 ku，均具有较好反应原性；抗rTgSAG1/GRA4的小鼠血清多克隆抗体能识别出293T细胞内表达的35 ku的SAG1和45 ku的GRA4弓形虫蛋白。成功构建了具有良好反应原性的重组猫疱疹病毒穿梭质粒 pBS-TK-SAG1/GRA4。

目录

声明

前言

1弓形虫概述

1.1弓形虫

1.2生活周期

1.3弓形虫遗传多样性

1.4 弓形虫入侵

1.5 弓形虫病

2 宿主免疫

3 弓形虫疫苗研究

3.1 灭活虫体、抗原或重组抗原

3.2 减毒活虫体疫苗

3.3 核酸疫苗

3.4 活载体疫苗

4 SAG1蛋白特性

5 GRA4蛋白特性

6 猫疱疹病毒l型

7 研究目的及意义

材料与方法

1 材 料

1.1 虫种及质粒

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4主各种溶液及培养基

2 方 法

2.1 弓形虫 RH的收集

2.2 引物设计

2.3 目的基因提取及克隆

2.4 重组表达质粒的构建及鉴定

2.5 重组蛋白的表达

2.6 重组蛋白的纯化

2.7 多克隆抗体的制备

2.8 多克隆抗体的间接免疫荧光实验

2.9 多克隆抗体的 Western Blot分析

2.10 FHV-1转移载体及穿梭质粒的构建及酶切鉴定

2.11 在 293T细胞中重组转移载体的表达

2.12 表达产物的 Western blotting 分析

结果

1 目的基因的扩增及克隆

1.1 目的基因的扩增

3.2 原核表达载体的鉴定

3.3重组蛋白的表达与纯化

3.4 间接免疫荧光

3.5 多克隆抗体的 Western Blot分析

3.6 FHV-1转移载体及穿梭质粒的构建与鉴定

3.7 Western blot分析表达产物

讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

附录（在研期间发表的论文）