玉米邻甲基转移酶基因的克隆、原核表达载体构建及其生物信息学分析

摘要

玉米的抗虫性与次生代谢物苯并噁嗪（benzoxazinoids）关系密切；玉米中存在的苯并噁嗪类化合物包括 DIBOA、DIMBOA、HDMBOA、DIM2BOA和HMBOA等；其中，DIMBOA和 HDMBOA因昆虫取食而转化为对昆虫有毒性的MBOA，相对而言HDMBOA转化为MBOA的速度比DIMBOA更快。在玉米中，DIMBOA和HDMBOA是以DIMBOA-Glc和HDMBOA-Glc形式存在，而HDMBOA-Glc是由DIMBOA-Glc在邻甲基转移酶的作用下合成而来。玉米中，邻甲基转移酶是由 bx12（又名 bx10c）基因编码；该基因的突变，导致DIMBOA-Glc无法转化为HDMBOA-Glc，最终造成不同玉米抗虫性的差异。然而，至今为止，关于bx12基因的表达与调控机理还不清楚。
　　为深入研究bx12基因的表达与调控机理，本研究从中国玉米自交系ZaC546中克隆出了含有目的基因bx12的目标DNA片段Zm3325-ZaC546，并构建出该基因的原核表达载体 pGEX4T1-Zm3325（bx12）。测序结果证明目标 DNA片段正确插入到pGEX-4T-1中；Zm3325-ZaC546的5’-末端与载体中的GST标签基因的3’-末端连接正确，目的基因与载体中的GST标签基因构成一个完全能够连续阅读的GST-Zm3325（bx12）融合基因。本研究中，从ZaC546基因组中分离的目标DNA序列长度为1010bp，含有完整的开放阅读框（ORF）。与玉米基因组数据库上的参考序列GRMZM2G023325相比，目标DNA序列在其ORF的内部，从起始密码子的第1个碱基开始，下游第204个碱基位置上存在一个碱基突变，由G突变为A，遗传密码由AAG变为AAA，但氨基酸不变，都编码赖氨酸（Lysine，K）。虽然，目标DNA序列在其ORF的下游，第883个碱基G发生缺失，第905个碱基由T突变为C，但因这两个突变位于ORF的下游，并不影响目的基因的编码活性。目标 DNA序列 Zm3325-ZaC546与参考序列的一致性（Identity）为99.70％，阅读框序列的一致性为99.87%；而由目的基因编码的蛋白质氨基酸序列与参考序列的一致性为100%。生物信息学分析结果表明，本研究中克隆的基因所编码的邻甲基转移酶蛋白属于邻甲基转移酶基因超级家族2。该酶是一种多功能酶，它具有两个大的结构域，一个位于N-末端一侧，具有甲基转移酶二聚化功能；另一个位于 C-末端一侧，具有甲基转移酶功能和邻甲基转移酶功能；该酶蛋白没有信号肽，这意味着该酶蛋白是在细胞质内合成后，并不涉及翻译后的转运，而是存在于细胞液中。

目录

声明

第一章 前言

1.1玉米取食昆虫

1.2抗虫类型

1.3 玉米防御机制

1.3.1玉米的可凝性球蛋白（Maysin）

1.3.2 绿原酸（Chlorogenic Acid）

1.3.3蛋白酶抑制剂（Protease Inhibitors）

1.3.4半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease）

1.3.5核糖体失活蛋白（Ribosome-Inactivating Proteins）

1.3.6硅（Silica）

1.3.7木质素（Lignin）

1.3.8 苯并噁嗪（Benzoxazinoids）

1.4 研究的目的及意义

第二章 玉米邻甲基转移酶基因的克隆及其原核表达载体构建

2.1材料与方法

2.1.1玉米材料

2.1.2 仪器

2.1.3 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 玉米邻甲基转移酶基因Zm3325(bx12)的克隆

第三章 目的基因编码的蛋白质 Zm3325ZaC546P 生物信息学分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 分析方法

3.2 结果与分析

3.2.1 Zm3325-ZaC546P的氨基酸组成

3.2.2 Zm3325-ZaC546P的理化性质

3.2.3目的蛋白质Zm3325-ZaC546P的信号肽及其细胞学定位预测

3.2.4 目的蛋白Zm3325-ZaC546P与其他邻甲基转移酶蛋白序列的的同源性

3.2.5 Zm3325-ZaC546P的功能分析

第四章 讨论与结论

4.1 讨论

4.2 结论

参考文献

致谢