碳酸酐酶IX在胃癌发病机制中的作用

摘要

研究背景:
　　胃癌是最常见的消化道肿瘤，全球每年约有70万例患者死亡。胃癌的发病经过多个过程，肠上皮化生及不典型增生是胃癌的癌前病变。多种遗传及表观遗传变化参与恶变及癌症进展过程，但其分子生物学基础仍不明确。因此，胃癌的诊断、治疗及预防需要研究发现新的分子生物学靶标。
　　碳酸酐酶(Carbonic anhydrase，CA)是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，是一种含Zn酶，可参与CO2转化成H+与HCO3-的可逆反应，从而调节细胞内外的PH。最初，CAIX被认为是一种肿瘤相关基因，在肿瘤发展过程中起重要作用。CAIX在大多数正常组织中不表达，但在肿瘤组织中高表达，并有着致癌活性。不过，在胃癌组织，CAIX高表达在正常胃粘膜，而在胃癌中被下调。胃癌中CAIX的分子生物学机制可能与其它癌症不同。关于CAIX在胃癌中的作用仍有争议，需要充分探讨。
　　目的:
　　阐明CAIX在胃癌发病机制中的重要作用,探讨相关信号传导通路及分子生物学机制。
　　方法：
　　1.应用reverse transcriptional PCR(RT-PCR)技术检测22种胃癌细胞中CAIX mRNA的表达情况。7种胃癌细胞中CAIX蛋白质的表达用western blot analysis进行检测。
　　2.利用methylation specific PCR（MSP）方法在22种胃癌细胞株、39例癌旁正常胃粘膜、2例肠上皮化生、9例不典型增生及33例胃癌组织中检测CAIX启动子的甲基化。
　　3.为进一步验证MSP结果,对5种胃癌细胞株、7对正常胃粘膜组织及胃癌组织进行bisulfite genomic sequencing(BGS)检测。
　　4.为了研究CAIX的下调与甲基化的相关性，胃癌细胞用5-Aza-2’-Deoxycitidine(5-Aza) and Trichostatin A(TSA)进行处理，再用RT-PCR检测CAIX的表达重现与否。
　　5.为检测CAIX高表达对胃癌细胞生物学行为的影响，建立CAIX高表达稳定细胞株(Mock-AGS，CAIX-AGS，Mock-MKN1 and CAIX-MKN1)。为了检测CAIX高表达对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，对CAIX高表达稳定细胞株进行July stage anaylsis、划痕试验和transwell analysis。
　　6.对CAIX高表达稳定细胞株进行xenograft analysis,观察CAIX高表达对肿瘤发生的影响。
　　7.对CAIX高表达稳定细胞株及GeneChip Human Gene1.0 ST Array X4进行cDNA microarray analysis，探讨相关信号传导通路。
　　8.应用免疫组织化学法检测103例胃癌患者组织中CAIX的蛋白表达情况，结合患者的临床特征进行分析，探讨CAIX在胃癌中的临床意义。
　　结果：
　　1.22种胃癌细胞株中有7种细胞株呈现CAIX mRNA的表达，并且在7种胃癌细胞株中有1种胃癌细胞株呈现CAIX蛋白表达。
　　2.19(86.4％),2(9.1%)及1(4.5%)种胃癌细胞株分别呈现出CAIX启动子的full methylation，unmethylation and partial methylation。癌旁正常胃粘膜、肠上皮化生、不典型增生及胃癌组织中也可频繁观察到CAIX启动子的甲基化。
　　3.BGS结果表明，胃癌组织的甲基化程度与正常组织的相比显著增高(P<0.001)。
　　4.5-Aza处理胃癌细胞可使CAIX的表达重现。
　　5.CAIX高表达可下调胃癌细胞迁移及侵袭(P<0.001,P<0.001)。
　　6.CAIX高表达可抑制肿瘤的形成(P<0.05)。
　　7.应用cDNA microarray筛选出了77个CAIX高表达相关候选基因组。
　　8.无淋巴结转移的胃癌患者与有淋巴结转移的胃癌患者相比，CAIX的表达在无淋巴结转移的患者中显著升高(P<0.05)，并且无CAIX表达的患者呈现较低的生存率(P<0.05)。
　　结论：
　　1.CAIX的表达在胃癌及其癌前病变组织与正常组织相比显著下降。
　　2.胃癌及其癌前病变组织中CAIX的下调与CAIX启动子的甲基化密切相关。
　　3.CAIX的高表达降低胃癌细胞迁移、侵袭及致瘤性。
　　4.CAIX的表达与胃癌患者的淋巴结转移及生存率密切相关。

目录

声明

中英文缩略词表

第一章 绪 论

第二章 CAIX的表达对胃癌细胞株生物学行为的影响

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3统计学方法

2.4结果与分析

第三章 CAIX的下调及甲基化在胃癌患者中的临床意义

3.1实验材料

3.2 实验方法

3.3 统计学方法

3.4 结果

第四章 讨 论

第五章 结 论

参考文献

致谢

【综述】:胃癌发病机制的研究进展

附录A：攻读学位期间发表的论文

附录B：攻读学位期间的科研成果

附录C：攻读学位期间参加的学术活动