载 4HPR脂质微泡联合超声对瘢痕疙瘩治疗作用的研究

摘要

目的：制备载N-（4-羟基苯基）维生素甲酰胺[N-(4-Hydroxyphenyl)retinamide]脂质微泡(4HPR loaded Lipid microbubbles，4HPR-LM)，探讨其联合超声对瘢痕疙瘩成纤维细胞（Human keloid fibroblasts，HKFs）增殖、凋亡及细胞周期的影响，以及建立裸鼠皮下瘢痕疙瘩种植瘤模型，考察4HPR-LM联合超声对肿瘤生长的抑制作用。
　　方法：通过薄膜-超声分散法制备载4HPR脂质体（4HPR loaded lipsome，4HPR-L），采用高效液相法（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）、动态光散射法（Dynamic Light Scattering，DLS）、透射电镜法（Transmission electron microscope，TEM）对其载药浓度、粒径分布、外观形态、Zeta电位、载药量、包封率及30日内稳定性和渗漏率进行考察。以4HPR-L为前体采用超声空化法制备4HPR-LM。采用细胞增殖抑制试验（CCK-8）法筛选合适超声参数及对空白脂质微泡（Blank-LM）的生物相容性进行评价，并检测游离4HPR、4HPR-L和4HPR-LM联合超声对HKFs的抑制作用；采用细胞划痕实验检测4HPR对HKFs侵袭能力影响；采用流式细胞术检测4HPR对HKFs的细胞周期阻滞作用及诱导细胞凋亡情况。HKFs接种法建立裸鼠皮下瘢痕疙瘩模型，观察4HPR-LM联合超声的体内抑瘤作用，并对其安全性进行评价。
　　结果：4HPR-L制备中探头超声参数为15min（功率200W，超声1s，间歇2s）。
　　（1）制备的4HPR-L载药浓度达1400μg/ml以上，粒径分布为（100.08±1.33）nm，PDI为（0.169±0.005），Zeta电位分布为（﹣34.27±2.27）mV，透射电镜下显示4HPR-L为外观圆整、大小均匀的球形或类球形结构，直径为100nm左右；包封率为（95.8±0.2）％，载药量为（8.26±0.35）%。4HPR-L（4℃）密封保存30天其外观、粒径及电位无明显变化，7天、15天、30天渗漏率分别为（2.15±0.27）%，（5.91±2.7）%，（8.3±0.7）%。（2）CCK-8实验表明单纯超声及Blank-LM对HKFs增殖无明显抑制作用，4HPR、4HPR-L和4HPR-LM联合超声对HKFs抑制作用均有时间和剂量依赖性，且相同浓度下4HPR-LM联合超声抑制作用明显优于4HPR组（P<0.05)；
　　（3）细胞划痕实验表明4HPR具有抑制HKFs运动及侵袭作用；
　　（4）流式细胞仪检测结果表明4HPR可有效诱导HKFs发生凋亡并可将细胞阻滞于G2-M期，且所有细胞实验中4HPR-LM联合超声表现出更好作用效果，明显优于游离4HPR。
　　（5）动物实验表明4HPR-LM联合超声有明显的抑瘤作用，治疗结束后瘤重、瘤体积与对照组相有显著差异（P<0.05)，实验期间所有裸鼠状态良好，体重无明显变化，各内脏器官 HE染色均未见器质性病变。
　　结论：
　　1.制备的4HPR-L稳定性好，药物浓度高，有效改善了4HPR低水溶性。
　　2.4HPR可抑制HKFs增殖、侵袭能力，并可发挥细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡作用。
　　3.HKFs接种法建立裸鼠皮下瘢痕疙瘩种植瘤模型，4HPR-LM联合超声具有显著的抑瘤作用。
　　4.脂质超声联合微泡可显著提高4HPR作用效果，安全性高，具有广泛的临床应用前景。

目录

声明

中英文对照表

前言

第一部分4HPR体外浓度测定方法的建立及载4HPR-L和4HPR-LM的制备与表征

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 小结

第二部分4HPR-LM联合超声对HKFs作用研究

1 实验材料与仪器

2实验方法

3 实验结果

4 小结

第三部分 4HPR抑制裸鼠瘢痕疙瘩种植瘤生长研究

1实验材料与仪器

2 实验动物

3 实验方法

4 结果

5 小结

第四部分 讨论

第五部分 结论

参考文献

致谢

【综述】:纤维蛋白溶解系统功能及其在瘢痕疙瘩发病中的作用

附录