基于糖苷内切酶的N-糖链分析方法研究

摘要

糖链具有结构多样化的特点，对于糖链的研究具有现实意义。糖链携带复杂的生物信息，与遗传、病理及人类生命活动有直接联系。糖基化过程与生理生化过程密切相关，也与癌症等多发疾病的发生及病变有关，本文选用两种糖苷内切酶Endo M和Endo M-N-175Q建立一种分析N-糖链的方法。Endo M-N-175Q作为Endo M的突变体，在保留转糖基活性的同时几乎丧失了水解活性，因此在延长酶反应时间的同时具有更高的转糖基效率。同时介绍了脱盐技术的发展情况，重点说明了采用石墨碳柱进行纯化和富集的简便性、高效性，本文通过对石墨碳柱富集寡糖洗脱方式的选择、酶切糖蛋白的酶的选择来建立一种分析糖蛋白中N-糖链的方法，成功将此方法应用于复杂糖蛋白卵清蛋白的分析实验当中，成功检测到八种寡糖。根据报导，恶唑啉无论是在化学糖基化法和化学酶糖基化法上面是已知的非常好的糖基供体。在以恶唑啉为底物时，使用Endo M-N-175Q进行转糖基反应转移率可达到90％以上。以此为前提，为了进一步提高酶反应的转移率，通过合成糖恶唑啉探索提高酶反应转移率的方法。
　　本文通过四组实验对N-糖链进行分析研究。首先，唾液酸糖肽经链霉蛋白酶E酶解，酶解产物通过石墨碳柱富集后进行Endo M-N-175Q酶反应，通过LC-ESI-MS检测产物生成与否最终从三种不同的洗脱方式选择中性洗脱方式作为富集寡糖的方法，将此方法应用于后续实验。其次，两组标准糖蛋白牛胰核糖核酸酶B分别经链霉蛋白酶E和N-糖苷酶F酶解，酶解得到的寡糖通过石墨碳柱富集后进行Endo M-N-175Q酶反应，经LC-ESI-MS检测。前者得到一种寡糖M5N2，后者得到三种寡糖M5N2、 M6N2、 M8N2且含量高于前者，选用N-糖苷酶F酶解糖蛋白。接着，将前文方法应用于复杂糖蛋白卵清蛋白中N-糖链的分析上，用N-糖苷酶F酶解卵清蛋白，酶解产物通过石墨碳柱富集，进行Endo M-N-175Q酶反应后经LC-ESI-MS检测得到M5N2等八种寡糖。最后，使用氮乙酰葡糖胺成功合成糖恶唑啉，将这一方法应用到唾液酸糖肽上，合成糖恶唑啉后进行EndoM-N-175Q酶反应。反应结果与唾液酸糖肽直接进行Endo M酶反应的结果对比，前者的积分峰面积是后者的14.2倍，以糖恶唑啉为底物时进行Endo M-N-175Q酶反应将显着提高酶反应转移率。

目录

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摘要

本论文涉及相关化合物的缩写

第一章 绪论

1．1 糖基化与相对定量检测方法

1．2 脱盐技术及石墨碳柱的发展与应用

1．3 糖噁唑啉

第二章 实验部分

2．1 试剂与仪器

2．1．1 试剂

2．1．2 仪器

2．2 石墨碳柱洗脱液的选择

2．2．1 石墨碳柱洗脱液的选择

2．2．2 石墨碳柱富集后进行酶反应

2．3 Pronase E与PNGase F的对比

2．3．1 Pronase E消化Ribo B并富集寡糖

2．3．2 寡糖的Endo M-N-175Q酶反应

2．3．3 PNGase F消化Ribo B并富集寡糖

2．3．4 寡糖的Endo M-N-175Q酶反应

2．4 卵清蛋白经PNGase F消化后进行Endo M-N-175Q酶反应

2．4．1 卵清蛋白经PNGase F消化并富集寡糖

2．4．2 寡糖的Endo M-N-175Q酶反应

2．5 合成嗯唑啉结构并酶反应

2．5．1 使用GlcNAc为合成GlcNAc-oxa

2．5．2 SGP进行Endo M酶反应与SGP合成SG-oxa后进行Endo MN-175Q酶反应的对比

第三章 结果与讨论

3．1 石墨碳柱洗脱液的选择

3．2 比较Pronase E与PNGase F的酶解

3．2．1 Pronase E消化Ribo B后进行Endo M-N-175Q酶反应

3．2．2 PNGase F消化Ribo B后进行Endo M-N-175Q酶反应

3．3 卵清蛋白经PNGase F消化后进行Endo M-N-175Q酶反应

3．4 糖基供体寡糖-噁唑啉的合成

3．4．1 使用GlcNAc为原料合成GlcNAc-oxa的结果讨论

3．4．2 分别以SGP、SG-oxa为糖基供体的Endo-MN1750酶反应比较

第四章 结论

参考文献

致谢