PGD2和L-PGDS对心房ANP分泌的信号转导机制研究

摘要

研究表明，磷脂酶A2(phopholipase A2，PLA2)促使心脏未脂质化花生四烯酸(arachidonic acid, AA)的累积，进而衍生前列腺素(prostaglandins，PGs)。各种PGs以不同亲和力结合不同的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)，参与调节心肌肥大、纤维化、梗死等多种心脏疾病的病理过程。
　　PGD2是1973年被发现的PGs一员，造血型前列腺素D合成酶(hematopoieticPGD synthase，H-PGDS)和载脂蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-type PGDsynthase，L-PGDS)是催化PGH2生成PGD2的两种酶。PGD2可通过其代谢产物15-deoxy-△12，14-PGJ2(15d-PGJ2)激活过氧化物酶体增生物激活受体γ（peroxisome proliferator-activate receptorγ，PPARγ），从而发挥抗炎、抗凋亡和镇定动脉粥样硬化的作用。PGD2也具有抵制缺血、缺氧和保护心脏的作用。
　　作为内分泌腺的心房合成和分泌心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP），其分泌受较多因素的调控，但血容量增加导致心房壁的牵张是调节ANP分泌的主要因素。研究表明，心房牵张、缺血、内皮素等因素最终能通过影响AA代谢并生成多种PGs调节心房ANP的分泌，如PGF2α和PGE2促进大鼠心房ANP的合成和分泌;PGF2α，PGE2和PGI2浓度依赖性地促进ANP分泌。虽然也有研究报道，PGD2促进ANP的分泌，但其作用机制尚不清楚。
　　因此，本研究利用大鼠离体搏动的心房灌流模型，采用放射免疫技术检测心房ANP的含量，利用蛋白免疫印迹技术(Western blot，WB)分析心房肌组织PPARγ蛋白含量，观察PGD2对大鼠心房ANP分泌及其机械活动的影响，并探讨PPARγ、促分裂元活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路对PGD2促进心房ANP分泌的作用。
　　本研究结果如下:
　　1.不同剂量的PGD2（0.1，1.0和10.0μmol/L）明显增加ANP的分泌和心房搏动压（与对照组相比，均P＜0.05），并呈现一定的时间依赖性特征(1.0μmol/L的PGD2;与对照循环比较，P＜0.05)。
　　2.PGD2受体抑制剂AH6809（1.0μmol/L）可完全阻断PGD2促进心房ANP分泌及其正性肌力作用（与对照循环比较，均P＞0.05）。而且PGF2α受体抑制剂AL8810(1.0μmol/L)也可完全消除PGD2对心房ANP分泌和机械活动的作用（与对照循环比较，P＞0.05）。
　　3.PGD2的代谢产物15d-PGJ2(0.1μmol/L)也显著增加心房ANP的分泌（与对照循环相比，P＜0.05），该作用与PGD2的作用相似。另外，15d-PGJ2明显抑制心房搏动压（与对照循环相比，P＜0.05）。PGD2受体抑制剂AH6809不仅能完全阻断15d-PGJ2促进心房ANP分泌的效应，而且还可完全解除15d-PGJ2对心房的负性肌力作用(与对照循环比较，均P＞0.05)。
　　4.PPARγ抑制剂GW9662(0.1μmol/L)可完全阻断PGD2及其代谢产物促进心房ANP分泌的效应（与对照循环相比，均P＞0.05），而且也可完全解除PGD2及其代谢产物对心房机械活动的作用（与对照循环相比，均P＞0.05）。另外，PGD2能显著增加心房肌组织PPARγ蛋白含量（与对照组相比，P＜0.05），该作用可被GW9662所完全阻断（与PGD2组相比较，P＜0.05）。
　　5.MAPK/ERK的抑制剂PD98059(10.0μmol/L)明显减缓PGD2促进心房ANP分泌的作用（与对照循环相比，P＜0.05），同时完全阻断PGD2对心房的正性肌力效应(与对照循环相比，P＞0.05)。另外，PI3K/Akt的抑制剂LY294002(1.0μmol/L)与PD98059的作用类似，也明显抑制PGD2促进心房ANP分泌的作用(与对照循环比较，P＜0.05)，但未能改变PGD2的正性肌力效应（与对照循环比较，P＜0.05）。
　　以上结果提示:
　　1.PGD2通过激活PPARγ信号通路促进离体搏动大鼠心房ANP的分泌，并发挥正性肌力作用;
　　2.MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路可部分地参与调节PGD2的作用过程。
　　第二部分：HIF-1α-L-PGDS-PPARγ对缺氧诱导心房ANP分泌的影响
　　载脂蛋白型前列腺素D合成酶(lipocalin-type prostaglandin D synthase，L-PGDS)是一种低分子糖蛋白。研究发现，L-PGDS在心脏中有表达，而且被认为是评价心血管疾病风险的新型生物标志物。
　　缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是异二聚体的转录因子，也是激活缺氧易感基因的核心调控因子。研究证实，缺氧强烈促进ANP的分泌，并促使细胞适应缺氧环境和保护缺血性心脏。另外有研究报道，在人和鼠类肥大的心肌组织中HIF-1α和过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activate receptorγ，PPARγ)的含量均明显增加，而且HIF-1α可直接激活PPARγ的转录使其发挥关键的下游效应。由于L-PGDS可催化PGH2生成PGD2，而PGD2的代谢产物15-deoxy-A12，14-PGJ2(15d-PGJ2)是PPARγ内源性配体，所以对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用。然而，在缺氧条件下HIF-1α-PPARγ信号通路是否参与调节缺氧诱导的心房ANP分泌尚不甚清楚，而且缺氧诱导的心房L-PGDS是否参与调节HIF-1α对PPARγ的转录过程也不清楚。
　　本研究假设，急性缺氧时HIF-1α通过激活心房L-PGDS的途径激活PPARγ信号通路，从而参与调节缺氧诱导心房ANP分泌的过程。因此，本研究利用离体搏动的大鼠心房灌流装置制备急性缺氧模型，采用放射免疫、Western blot技术和生理学及药理学等方法，选用相应抑制剂探讨并证明上述假设，为研究和阐明HIF-1α调控缺氧诱导心房ANP分泌的作用及其机制提供必要的理论和实验数据。
　　本研究结果如下:
　　1.缺氧以时间依赖性地强烈促进心房ANP的分泌，其分泌在缺氧第四循环末（约在缺氧后48 min）达到峰值（与对照循环比较，P＜0.05），并伴随心房搏动压的显著抑制（与对照循环比较，P＜0.05）。
　　2.缺氧明显增加心房肌组织HIF-1α的含量(与对照组比较，P＜0.05)，并显著增加心房ANP的分泌（与对照循环比较，P＜0.05）。而HIF-1α的抑制剂rotenone（0.5μmol/L）不仅可完全阻断缺氧增加HIF-1α含量的作用（与单纯缺氧组比较，P＜0.05），而且也可明显减缓缺氧增加心房ANP分泌的效应（与对照和第四单纯缺氧循环比较，均P＜0.05）。
　　3.缺氧明显增加心房肌组织L-PGDS含量（与对照组比较，P＜0.05）。L-PGDS的两种抑制剂AT56（5.0μmol/L）和HQL49（5.0μmol/L）可显著减缓缺氧增加心房肌组织L-PGDS含量的效应（与对照组比较，均P＜0.05;与缺氧组比较，均P＜0.05）;同时也显著减缓缺氧诱导心房ANP分泌的作用（与对照和第四单纯缺氧循环比较，均P＜0.05）。
　　4.PPARγ抑制剂GW9662(0.1μmol/L)明显减缓缺氧增加心房ANP分泌的效应（与对照循环比较，P＜0.05;与单纯缺氧比较，P＜0.05）。该作用与HIF-1α的抑制剂rotenone和L-PGDS的抑制剂AT56对缺氧诱导ANP分泌的作用类似（与对照循环比较，P＜0.05;与单纯缺氧比较，P＜0.05;与rotenone和AT56比较，均P＞0.05）。
　　5.缺氧显著增加心房肌组织PPARγ的含量（与对照组比较，P＜0.05）。而rotennone不仅可完全阻断缺氧增加心房肌组织L-PGDS含量的作用，也可完全解除缺氧对PPARγ的效应;AT56则可模仿rotennone对缺氧心房PPARγ的抑制作用（与对照组比较，均P＞0.05;与缺氧组比较，P＜0.05）。另外，将rotennone和AT56联合预处理时，其对PPARγ，的阻断效应要比各自的效应呈现微弱的叠加趋势，但与各自比较未呈现显著性差异（与rotenone和AT56比较，均P＞0.05）。
　　以上结果提示:
　　1.急性缺氧可通过HIF-1α激活L-PGDS并参与调节离体搏动大鼠心房PPARγ的活性;
　　2.HIF-1α-L-PGDS-PPARγ通路是缺氧促进心房ANP分泌的重要机制之一。

目录

声明

研究背景

参考文献

第一部分 PPARγ信号通路对PGD2促进大鼠心房ANP分泌的影响

摘要

第一章 前言

第二章 实验材料与方法

2．1 实验试剂

2．2 实验溶液的配制

2．3 主要实验仪器

2．4 实验动物

2．5 实验方法

2．6 实验步骤

2．7 统计学处理

第三章 实验结果

3．4 PPARγ对PGD2和15d-PGJ2诱导心房ANP分泌和机械活动的影响

3．5 MAPK／ERK和PI3K／Akt对PGD2促进心房ANP分泌和机械活动的影响

附图

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

第二部分 HIF-1α-L-PGDS-PPARγ对缺氧诱导心房ANP分泌的影响

摘要

第一章 前言

第二章 实验材料与方法

2．1 实验试剂

2．4 实验动物

2．5 实验方法

2．6 实验步骤

2．7 统计学处理

第三章 实验结果

3．1 急性缺氧对大鼠心房ANP分泌和机械活动的影响

3．4 PPARγ对缺氧诱导心房ANP分泌的影响

3．5 HIF-1α对缺氧诱导心房L-PGDS及PPARγ蛋白含量的影响

附图

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读博士期间科研情况