万金文武汤对大鼠糖尿病性心肌病的保护作用及其机制研究

摘要

目的:
　　1.观察朝医方万金文武汤对糖尿病心肌病大鼠的血清指标及形态学结构的影响;
　　2.阐明万金文武汤对大鼠糖尿病心肌病发挥保护的作用机制;
　　3.探讨万金文武汤对糖尿病大鼠抗心肌缺血/再灌注损伤的作用机制。
　　方法:
　　1.健康雄性SD大鼠共60只，即正常组（Control组）10只，其余50只一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg，72 h后测空腹血糖≥11.1 mmol/L确定糖尿病模型造模成功。正常饲养1个月后，开始灌胃给药。
　　2.糖尿病大鼠随机分为5个组进行灌胃:(1)糖尿病组（DM组），给予生理盐水，1 mL/kg/d;(2)万金文武汤低剂量组（WJL组），给予万金文武汤300mg/kg/d;(3)万金文武汤高剂量组（WJH组），给予万金文武汤600 mg/kg/d;(4)二甲双胍组（Met组），给予二甲双胍140mg/kg/d;(5)泽兰水提取物组(ALT组)，给予泽兰水提取物200 mg/kg/d。灌胃8周，每日一次。
　　3.药物灌胃8周结束后，每组各5只，麻醉，结扎冠状动脉左前降支构建心肌缺血/再灌注模型(缺血30min/再灌注60min)，正常假手术组(Sham Control组)只穿线不结扎，并持续观察心电图变化。
　　4.通过试剂盒检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、MDA、CK-MB以及血液中的GHb的变化;Western Blot法检测心肌细胞HIF-1α、HO-1、VEGF、NF-κB、GSK3β、p-GSK3β、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3的蛋白表达;通过电镜观察心肌组织超微结构;免疫组化检测HIF-1α和VEGF的变化;HE染色观察心肌细胞结构变化。
　　结果:
　　1.经药物灌胃8周后，与糖尿病模型组相比，万金文武汤高剂量组的血糖和GHb明显降低(P＜0.05)，血清TC、TG、LDL-C、MDA、CK-MB明显下降（P＜0.01），血清SOD、HDL-C值出现显著上升(P＜0.01)。
　　2.通过Western Blot法发现，在糖尿病心肌病中，与糖尿病模型比较万金文武汤高剂量组的HIF-1α、HO-1、VEGF水平明显下降（P＜0.05），炎症因子NF-κB水平明显下降(P＜0.05)，p-GSK3β/GSK3β水平明显上调(P＜0.05)，Bcl-2/Bax水平明升高(P＜0.05)，Cleaved-caspase-3/caspase-3水平明显上升(P＜0.05)。在心肌缺血/再灌注损伤中，与糖尿病I/R比万金高文武汤剂量I/R的HIF-lα、HO-1、VEGF水平明显上升（P＜0.05），炎症因子NF-κB水平明显下降(P＜0.05)，p-GSK3β/GSK3β水平明显上调(P＜0.05)，Bcl-2/Bax水平明升高（P＜0.05），Cleaved-caspase-3/caspase-3水平显著升高（P＜0.05）。
　　3.电镜结果显示，与糖尿病模型组相比，万金文武汤高、低剂量组均有不同程度改善。
　　4.免疫组化结果显示，与糖尿病模型组比，万金文武汤高剂量组的HIF-1α和VEGF表达明显减少(P＜0.05)。
　　5.HE染色显示，万金文武汤高、低剂量组均有改善糖尿病心肌病导致的心肌细胞排列及形态变化。
　　结论:
　　1.万金文武汤对大鼠糖尿病心肌病损伤发挥保护作用，其机制可能与调控HIF-1α，进而调节其下游的HO-1和VEGF表达，并抑制NF-κB等炎症因子，降低磷酸化的GSK-3β活性，减少Bcl-2/Bax比值及caspase-3等凋亡相关蛋白表达有关。
　　2.万金文武汤可以改善糖尿病心肌病大鼠的心肌缺血/再灌注损伤，其机制可能与调控HIF-1α/HO-1和HIF-1α/VEGF信号通路，并降低NF-κB等炎症因子表达，抑制磷酸化的GSK-3β活性，下调Bcl-2/Bax比值及caspase-3等凋亡相关蛋白表达有关。

目录

声明

常用名词中英文对照和缩略语

摘要

第一章 前言

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 实验药物与试剂

1．3 配制溶液

1．4 实验仪器及耗材

2 实验方法

2．1 万金文武汤和泽兰水提取物的制备

2．2 糖尿病大鼠模型制备

2．3 大鼠急性心肌缺血／再灌注模型制备

2．4 大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量

2．5 大鼠血清中SOD、MDA、CK-MB和溶血液中GHb的含量

2．6 Western Blot检测HIF-1α、HO-1、VEGF、NF-κB、GSK-3β、p-GSK-3β、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved-caspase-3蛋白表达

2．7 免疫组化测定HIF-1α和VEGF的表达

2．8 HE染色

2．9 心肌超微结构的电镜表达

2．10 统计学分析

3 实验结果

3．1 糖尿病大鼠血糖、GIIb、SOD、MDA、CK-MB的表达

3．2 糖尿病大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的表达

3．3 Western Blot法检测糖尿病大鼠心肌组织中HIF-1α、HO-1、VEGF的蛋白表达

3．4 Western Blot法检测糖尿病大鼠心肌组织中GSK-3β、p-GSK-3β、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3的蛋白表达

3．5 Western Blot法检测糖尿病大鼠心肌组织中NF-κB的蛋白表达

3．6 电镜观察糖尿病大鼠心肌组织超微结构的变化

3．7 HE染色法观察糖尿病大鼠心肌细胞形态结构的变化

3．8 免疫组化检测糖尿病大鼠心肌组织HIF-1α和VEGF蛋白表达

3．9 Western Blot法检测糖尿病大鼠心肌I／R后心肌组织HIF-1α、HO-1、VEGF的蛋白表达

3．10 Western Blot法检测糖尿病大鼠心肌I／R后心肌组织中GSK-3β、p-GSK-3β、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3的蛋白表达

3．11 Western Blot法检测糖尿病大鼠心肌I／R后心肌组织中NF-κB的蛋白表达

4 讨论

5 结论

参考文献

第三章 文献综述

致谢