积雪草酸通过Lipin1/TLR4信号通路调控肝纤维化作用机制的研究

摘要

目的:积雪草酸(Asiatic acid，ASA)是中药材积雪草的主要化学成份之一是五环三萜类化合物。研究显示积雪草酸具有很好的肝保护作用，本研究采用硫代乙酰胺(TAA)诱导小鼠肝纤维化模型，采用不用刺激物活化肝星状细胞，小鼠巨噬细胞以及人单核巨噬细胞，探讨积雪草酸通过Lipin1-TLR4-NLRP3信号通路对肝纤维化的改善作用和具体的调控机制。
　　方法:腹腔注射TAA(200mg/kg或100mg/kg)，共五周，制作小鼠肝纤维化模型。并每天灌胃小鼠以不同剂量的积雪草酸(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)，每天灌胃，连续4周。最后一次给药18h后，获得小鼠血清和肝脏，保存于存于-80℃冰箱。用血清检测试剂盒测定血清中谷丙氨酸转氨酶(Alanineaminotransferase，ALT)、天门冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)的水平。肝脏组织做H&E染色、Masson染色、天狼猩红染色与IHC免疫组织化学4种方法染色，观察肝组织病理学改变。检测肝纤维化指标α-SMA与炎性因子TLR4和Lipin-1/2的蛋白与mRNA表达水平。
　　对数生长期的大鼠肝星状细胞(HSC)，首先用TGF-β(10 ng/ml)激活1h，然后孵育以不同剂量的积雪草酸(1.56、3.125、6.25、12.5、25μmol/L)6 h，提取细胞总蛋白，做蛋白印迹(Western blotting)分析，检测α-SMA与TLR4、Lipin-1/2等蛋白表达水平。同时取对数生长期小鼠巨噬细胞(Raw264.7)与人单核巨噬细胞（THP-1）细胞，用LPS(1 ng/ml)刺激1h使细胞活化，然后孵育以不同剂量的积雪草酸(6.25、12.5或25μmol/L)6 h，进行细胞免疫荧光实验与蛋白印迹分析，测定TLR4、 Lipin-1、P2X7R等蛋白表达水平。
　　结果:在体内实验中，与硫代乙酰胺模型组相比，积雪草酸抑制了硫代乙酰胺导致的肝纤维化小鼠血清中ALT、AST活性的升高;积雪草酸抑制了硫代乙酰胺诱导的α-SMA、Collagen-I的表达，同时下调TIMP-1/MMP-13的比率;积雪草酸显著下调TLR4-Lipin-1，激活Lipin2的表达。
　　在体外细胞实验中，积雪草酸剂量为1.65-25μmol/L时对大鼠肝星状细胞无细胞毒性，积雪草酸能够明显的α-SMA，TLR4，Lipin1的表达，并增加Lipin2的水平。
　　LPS是类脂多糖类物质，能够刺激小鼠巨噬细胞（Raw264.7）产生炎性因子，诱导活化单核巨噬细胞(THP-1)。与单独给予LPS刺激相比，给予LPS活化的Raw264.7与THP-1细胞在不同浓度（1.56、3.125、6.25、12.5和25μM）的积雪草酸孵育后，积雪草酸能显著抑制Lipin-1活化，积雪草酸剂量为25μM时，对其抑制效果更为显著;TLR4、P2X7R也具有相同效果。给予活化的肝星状细胞积雪草酸孵育后，25μM积雪草酸能够显著降低α-SMA，Collagen-Ⅰ的蛋白水平;剂量为6.25、12.5、25的积雪草酸能够抑制TLR4的表达进而抑制Lipin-1的表达。
　　结论:积雪草酸(ASA)可能通过激活Lipin2抑制TLR4，进而抑制Lipin-1和P2X7R的表达进而改善硫代乙酰胺诱导的肝纤维化，并且通过抑制α-SMA抑制肝星状细胞的激活。由CD14提呈的LPS，能与Toll样受体4(Toll like receptor4，TLR4)结合，并且成复合体，诱发炎性细胞的活化。本研究发现，LPS可以通过CD14内化与TLR4共同进入细胞内体，进而发挥其对单核/巨噬细胞的活化作用。因此，本研究旨在探讨LPS-TLR4复合物的内化途径及其对LPS活化巨噬细胞的作用及可能机制。LPS通过激活Raw264.7与THP-1细胞，激活脂质代谢因子Lipin-1的表达，进而激活TLR4信号通路。所以积雪草酸通过有效地抑制Lipin-1与P2X7R的表达进而抑制TLR4/IRAK4的表达。