线粒体自噬途径在小白菊内酯诱导胃肠道间质瘤细胞凋亡中的作用

摘要

目的:探讨线粒体自噬作用在小白菊内酯(Parthenolide)诱导的胃肠道间质瘤细胞凋亡的影响及其机制。
　　方法: GIST-882细胞株完成体外培养，利用MTT法测定不同浓度PTL(3μmol/L,5μmol/L,7μmol/L，and9μmol/L)培育24小时后对GIST-882细胞的增殖抑制率;选取PTL对GIST-882细胞增殖抑制的IC50浓度组，将其作为实验组，进行接下来的一系列实验。利用流式细胞仪对对照组及实验组的早期凋亡率进行检测，并在各组中分别加入自噬抑制剂3-MA培养24小时后再次进行凋亡率变化的对比;从实验组及对照组的GIST-882细胞中提取线粒体，利用JC-1荧光探针方法检测线粒体膜电位变化;采用Western blot法测定对照组与实验组GIST-882细胞Bcl-2与Bax凋亡相关蛋白的表达、Becline1与LC3Ⅱ/Ⅰ自噬相关蛋白表达量及线粒体自噬相关蛋白Pink1的表达水平;透射电镜观察对照组与实验组GIST-882细胞的形态变化;
　　结果:MTT法结果表明PTL具有抑制GIST-882细胞增殖的作用(P＜0.05)，其抑制率随浓度升高而上升，PTL对GIST-882细胞的IC50为7μmol/L。流式细胞仪实验结果显示PTL够能够促使GIST-882细胞早期凋亡，在GIST-882细胞中单独加用5mmol/L自噬抑制剂3-MA后其凋亡率无明显变化，然而使用IC50浓度的PTL联用5mmol/L自噬抑制剂3-MA之后会明显降低PTL的促凋亡率(P＜005)。利用JC-1实验观测到提取出的，经过PTL进行24小时处理的GIST-882细胞中的线粒体，其膜电位降低，发出绿色荧光，细胞趋向于凋亡。细胞划痕实验表明相比于对照组，PTL组细胞的迁移能力降低(P＜005)。Western blot方法表明加入IC50浓度的PTL后，凋亡抑制蛋白bcl-2表达水平明显的降低，促凋亡蛋白bax表达显著增高(P＜005)，自噬关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Becline1的表达显著提高(P＜0.05)，线粒体自噬相关蛋白PINK1(mito)表达明显增加，而PINK1(cyto)表达降低(P＜0.05)。透射电镜下观察到用PTL处理24小时后的GIST-882细胞胞浆内出现大量的自噬体。
　　结论:1.PTL能抑制GIST细胞的增殖并促进GIST细胞的自噬。2 PTL可以通过线粒体自噬通路促使GIST细胞凋亡。

目录

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摘要

中英文缩略词表

第一章 前言

第二章 材料和方法

2．1．3 主要仪器和设备

2．2．1 细胞培养

2．2．2 MTT法检测

2．2．4 JC-1实验

2．2．5 细胞划痕实验

2．2．6 蛋白印迹法(Western blot)

2．2．7 超微结构观察

2．3 统计学分析

第三章 结果

3．2 流式细胞仪细胞凋亡率检测结果

3．3 JC-1实验结果

3．4 细胞划痕实验结果

3．5 Western blot检测结果

3．6 超微结构观察结果

第四章 讨论

4．1 PTL对GIST细胞增殖及凋亡的影响

4．2 线粒体自噬与PTL诱导GIST细胞凋亡

第五章 结论

参考文献

致谢

[综述]自噬在癌症治疗中的研究进展

附录