忽地笑叶相关基因表达及克隆分析

摘要

忽地笑(Lycorisaurea)为石蒜属植物代表种，是优良的观赏植物和药用植物。国内外学者已经进行了一些研究，主要包括栽培繁育技术、染色体核型分析、重要药用成分提取等方面，但是有关其遗传发育方面的研究尚未见报道。本文利用基因芯片技术，开展了一种忽地笑突变体与野生型叶器官之间的基因表达差异分析，为进一步探讨其叶发育分子机制提供了依据。 忽地笑属平行脉序类型，主脉与各侧脉纵向平行排列，各纵向脉之间有横向二级侧脉相连，一般二级侧脉不显著。本研究所选材料为一种忽地笑突变型，称为RaisedSecondaryLateralVeinsmutant(RSLV)，其叶片远轴面二级侧脉显著凸起，部分叶片尖端弯曲；生长势弱于野生型，叶色暗绿，相对较薄；另外，雄蕊完全退化，成为只有雌蕊的重瓣单性花。 利用表达型噬菌体载体ZAP构建了野生型和突变体忽地笑叶片cDNA文库，分别随机挑取cDNA克隆进行5’端测序，共得到3122条有效ESTs。利用这些ESTs序列，设计512条70mer的特异性序列作为寡核苷酸探针，代表512个基因，点制芯片，对忽地笑野生型和突变体叶器官进行了基因表达谱分析，比较二者间转录水平上的基因表达差异。芯片实验结果进一步采用实时定量PCR技术验证，最终确定所检测的基因中，突变型和野生型有5个基因表达显著差异，包括与维管发育和营养物质运输相关的韧皮部蛋白2基因(phloemprotein2，PP2)；与铁元素贮存、分配，维持细胞内铁离子平衡相关的铁蛋白(ferritin)基因；催化果胶脱酯化，与细胞壁结构和功能相关的果胶甲酯酶(pectinmethylesterases，PMEs)基因；以及叶绿素a/b结合蛋白和丙酮酸脱羧酶等。我们进一步采用RACE方法获得了这几个基因的全长cDNA序列，并比较了它们在突变体和野生型中的差异。这些基因的表达差异可能与突变表型的形成和维持相关，根据对这些基因的分析结果，有助于我们从转录水平上更深入地理解忽地笑叶发育的分子机制以及RSLV突变对叶片代谢及生长发育的影响。

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