忽地笑叶器官发育相关基因表达谱分析

摘要

忽地笑(Lycorisaurea)为石蒜属(LycorisHerb)植物的代表种,属秋出叶类型.在种质资源采集过程中,我们发现了一种忽地笑突变型,其叶片生长势弱于野生型,尖端卷曲,叶背面有灰白色网络,似溶生腔;其雄蕊完全退化,成为只有雌蕊的重瓣单性花.为全面分析忽地笑叶器官发育相关的基因表达谱,并据此分析野生型和突变型形态、生理差异的分子机制,我们分别采用忽地笑野生型(以下简称CK)叶片、突变型(以下简称MU)叶片,利用ZAP表达载体,构建了两个cDNA文库.分别随机挑取cDNA克隆进行5'端大规模测序,去除空载体和低质量(Q20,＜100bp)序列后,共得到3122条有效ESTs,总计1,319,026bp,平均长度422.5bp,所获得的有效ESTs已经提交GenBank数据库.其中CK文库1312条,总计528824bp,平均长度403.1bp,平均质量数39.54,平均GC含量48.33﹪,登录号CN453347～CN454651、CN477240～CN477246;MU文库1810条,总计790202bp,平均长度436.6bp,平均质量数40.13,平均GC含量47.51﹪,登录号CN451546～CN453346、CN477231～CN477239.有效EST序列采用Phrap软件进行拼接(Assembly),共获得1999个非重复序列(UniGene),其中包括489个重叠群(Contigs),1510个独立的ESTs(Singletons).所有Contigs序列中,Contigsize最大为45,最小为2,平均Contigsize为3.30条ESTs,由2条和3条ESTs组成的Contigs占主要部分.其中:CK文库所特有的UniGene798个,包含1119条ESTs;MU文库所特有的UniGene1137个,包含1635条ESTs;两个文库所共有的UniGene64个,包含368条ESTs.说明这两个文库的冗余度较低.将拼接获得的Unigene用BLAST软件对GenBankNtDatabase,GenBankNrDatabase,SWISSPROTDatabase作序列相似性比对,并选取最好的一个注释.在三个数据库中均没有注释到的有549个,包含654个ESTs,占全部Unigene的27.46﹪,全部ESTs的20.95﹪,这些序列为新的候选基因.我们进一步进行了基因芯片(DNAmicroarray)分析.利用所得到的Unigene序列,根据注释信息,设计得到512条70mer的特异性序列作为寡核苷酸探针,代表512个基因,点制芯片,对忽地笑两种类型叶器官进行了基因表达谱分析.根据差异基因筛选标准(Ratio≥2或≤0.5),芯片杂交结果分析发现突变型和野生型仅7个基因差异表达,突变型于野生型相比,有2个基因表达上调,5个下调,表达情况与其相应的ESTs丰度基本一致.进一步采用实时定量PCR技术验证芯片实验结果,其中上调基因得到验证,有一个下调基因没有得到验证.2个上调基因,其中一个是光合作用相关蛋白;另一个表达水平相差一个数量级,注释为是lectin-like蛋白,但是其与数据库中的蛋白序列一致性仅为44﹪,具体功能有待获取全长序列后进一步分析.得到验证的4个下调基因分别为:1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid(ACC)oxidase、Ferritin3(SFerH-3)以及两个pyruvatedecarboxylase同功酶.这些差异基因可能与忽地笑突变型的形成相关.