休哈塔假丝酵母抑制性差减文库的建立及其分析

摘要

本文首次利用抑制性差减杂交技术，成功建立戊糖代谢典型菌株休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)己糖和戊糖代谢的抑制性差减文库，主要结果如下：
　　 分别以木糖和葡萄糖为碳源培养C.shehatae，采用TRIZOL方法提取总RNA，然后用mRNA纯化试剂盒方法，纯化出mRNA。用抑制性差减文库构建试剂盒构建出C.shehatae的抑制性差减文库，包括正库和反库。对文库的质量进行鉴定后，分别选取正、反两个文库中的部分差异性片段进行基因测序，其中正库测定了1000条EST，反库测定了500条EST。
　　 用Phred/Phrap/Consed软件包对测得的差异EST分别拼接，用BLAST软件对Genebank Nt Database， Genebank Nr Database， SWISSPROT Database作序列相似性比对，用GO分类方法，对比对后的基因进行分类。用实时荧光定量分析方法对文库中部分差异基因进行分析，结果进一步表明，本研究所获得的两个文库的质量较好。
　　 本研究成功得到了休哈塔假丝酵母在不同碳源培养下所表达出的部分差异基因信息和与木糖代谢流相关联的部分基因，在转录水平上对戊糖酵母糖代谢的功能基因进行了初步的研究，本研究成果可为木糖代谢微生物的分子代谢机制、转录水平调控和重组菌株的构建等相关研究提供了一个良好的技术平台，其生物信息的深入挖掘可为木糖发酵产乙醇的系统研究提供理论指导，为纤维素乙醇的研发奠定理论基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1前言

1.1研究背景

1.2本研究的目的和内容

2文献综述

2.1木糖发酵

2.1.1燃料乙醇

2.1.2植物纤维原料

2.1.3木糖代谢途径

2.2木糖代谢的分子生物学研究

2.2.1代谢木糖的天然微生物

2.2.2代谢木糖的重组菌

2.2.3木糖代谢的分子调控研究

2.3基因文库

2.3.1基因组文库

2.3.2 cDNA文库

2.3.3抑制性差减文库

2.3.4 cDNA文库的应用

2.4差异表达基因的筛选方法

2.4.1 mRNA差异显示PCR

2.4.2代表性差异分析

2.4.3 DNA微阵列技术

2.4.4抑制性差减杂交技术

3休哈塔假丝酵母抑制性差减文库的建立

3.1材料和试剂

3.1.1材料

3.1.2试剂

3.2实验方法

3.2.1细胞培养

3.2.2总RNA提取

3.2.3 mRNA的纯化

3.2.4抑制性差减杂交

3.2.5抑制性差减文库的构建

3.3结果与分析

3.3.1细胞培养

3.3.2提取RNA方法的比较

3.3.3 mRNA的纯化

3.3.4第2次PCR扩增结果

3.3.5文库蓝白斑筛选

3.3.6阳性克隆插入片段筛选

3.4小结与讨论

4差异序列测定及生物信息学分析

4.1差异序列测定

4.1.1材料和试剂

4.1.2实验方法

4.1.3结果与分析

4.2差异序列的生物信息学分析

4.2.1差异序列拼接

4.2.2 DNA序列比对

4.2.3 GO分析

4.2.4序列信息分析方法

4.2.5差异序列生物信息学分析结果

4.3小结与讨论

5差异基因的表达分析

5.1材料与试剂

5.2实验方法

5.3结果与分析

5.4小结与讨论

6结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献