杨树抗杨四瘿螨抑制消减文库构建及表达谱分析

摘要

杨四瘿螨[Tetra lobulifera(Keifer)]为世界性分布的杨树重要害螨，在我国为一新纪录种，国内尚无对该螨的详细报道，杨四瘿螨为其暂定中文名。
　　 本实验对杨四瘿螨生物学特性做了初步研究。在相同立地条件下，随着杨四瘿螨危害程度的加剧，寄主的生长势被削弱且受害越严重的杨树，其侧枝发达，主干生长缓慢。
　　 采用抑制性消减杂交技术(SSH)，以杨四瘿螨诱导48、72h的美洲黑杨无性系为实验方(tester)，以未经诱导的美洲黑杨无性系为驱动方(driver)构建杨四瘿螨诱导差异表达的抑制消减cDNA文库，共获得了710个克隆，测序拼接得到496条有效EST序列。通过BLAST对比分析，获得了一批涉及胁迫响应、信号传递及能量代谢等功能的差异基因。通过Realtime-PCR技术对候选基因进行了表达分析，有10个候选基因在4个时间点表达量有明显上升的趋势。
　　 运用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术克隆获得两个候选基因的全长序列，命名为PtWRKY和PtERF。PtWRKY cDNA序列全长为2053bp，编码588个氨基酸的开放阅读框(ORF)，具有2个WRKY基因典型的结构域；PtERF为全长1074bp的序列，编码包含210个氨基酸的开放阅读框，氨基酸序列符合典型的AP2/ERF转录因子特征。构建了两个候选基因的过量表达载体，并进行杨树遗传转化，对筛选获得的植株进行PCR和实时定量检测，实验结果显示相关基因已整合到杨树基因组中。

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致谢

第一章 文献综述

1.1林木抗虫研究进展

1.2植物抗螨研究进展

1.2.1形态特征与抗螨的关系

1.2.2植物化学物质与抗螨的关系

1.2.3螨类在分子水平上的研究

1.3植物抗虫相关基因的研究

1.3.1昆虫取食诱导的植物防御相关基因

1.3.2信号传导相关基因

1.4差异表达基因检测技术研究进展

1.4.1 mRNA差异显示技术

1.4.2 RNA随机引物聚合酶链式反应

1.4.3代表性差示分析

1.4.4基因表达序列分析

1.4.5抑制消减杂交技术

1.4.6基因鉴定整合程序

1.4.7基因芯片技术

1.5 SSH技术在植物功能基因组学研究中的应用

1.5.1植物的生长发育及组织特异性研究

1.5.2生物胁迫诱导的基因差异表达研究

1.5.3非生物胁迫诱导的基因差异表达研究

1.6生物信息学

1.7 cDNA末端快速扩增技术(RACE)

1.8研究目的及意义

第二章 杨四瘿螨生物学特性研究

2.1实验方法

2.1.1杨四瘿螨种类鉴定

2.1.2杨四瘿螨形态特征

2.1.3对杨树的危害

2.2实验结果

2.2.1杨四瘿螨种类鉴定及形态特征观测

2.2.2对杨树的危害

2.3讨论

2.3.1杨四瘿螨形态特征观测

2.3.2对杨树的危害

第三章 杨四瘿螨诱导的美洲黑杨抑制消减文库的构建及分析

3.1实验材料

3.2实验方法

3.2.1 RNA的提取分离

3.2.2 mRNA分离

3.2.3抑制消减文库构建

3.2.4 PCR扩增产物纯化

3.2.5重组子筛选(T/A克隆法)

3.2.6 EST数据处理

3.2.7 Realtime-PCR检测

3.3实验结果

3.3.1总RNA的分离

3.3.2两次PCR扩增结果

3.3.3外源插入片断PCR检测

3.3.4 EST序列获得

3.3.5 Realtime-PCR检测

3.4讨论

3.4.1 SSH抑制消减文库构建

3.4.2 EST序列分析

第四章 抗杨四瘿螨相关基因克隆

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

4.1.2 PtWRKY和PtERF基因全长克隆

4.1.3电泳产物切胶回收

4.2实验结果

4.2.1总RNA的分离

4.2.2 PtWRKY基因cDNA全长的克隆

4.2.3 PtERF基因cDNA全长的克隆

4.3讨论

4.3.1 PtWRKY基因

4.3.2 PtERF基因

第五章 抗杨四瘿螨相关基因功能验证

5.1实验材料

5.1.1植物材料

5.1.2抗生素

5.1.3植物培养基

5.2实验方法

5.2.1植物表达载体构建

5.2.2遗传转化

5.2.3转基因杨树的PCR检测

5.2.4 Realtime-PCR检测

5.3实验结果

5.3.1 TOPO反应阳性克隆检测

5.3.2 LR反应阳性重组子检测

5.3.3农杆菌介导的遗传转化

5.3.4转基因植株的获得

5.3.5转基因T89杨DNA的提取

5.3.6转基因T89杨的PCR检测

5.3.7 Realtime-PCR检测

5.4 讨论

全文主要结论

本研究主要创新点及论文的不足与展望

参考文献