大蒜细胞周期中核仁超微结构与rRNA转录及剪切位点的动态变化

摘要

核仁是真核生物细胞核内重要的结构和功能区域，是细胞核内产生核糖体的机器。rRNA基因依赖RNA聚合酶I在核仁中转录合成rRNA前体，并剪切加工形成18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA，进一步组装成核糖体大小亚单位。在电子显微镜观察下，核仁主要分为纤维中心(FC)，致密纤维组分(DFC)和颗粒区(GC)三个结构区域，其中圆形的FC和环绕在它周围的DFC组成相连、统一的结构单位。长期以来，研究者们对核仁中rRNA基因的精确位置及其转录位点、转录后形成rRNA前体的剪切位点等问题进行了深入的研究，但对核糖体前体形成过程中每一步骤具体发生在核仁中的准确位置仍不是很清楚，即使采用相同的方法结果也不同。不过以前对核仁结构和功能的研究大多只是对细胞间期中某个时期细胞的核仁进行静态研究，然而核仁是一个高度动态变化的结构，在细胞分裂前期解体，在细胞分裂末期又开始重建。即使在核仁相对稳定的细胞分裂间期，核仁的超微结构也是随着G1、S和G2时期的不同而变化，这可能是产生这些分歧的一个重要原因。
　　 本文采用高等植物大蒜作为实验材料，利用羟基脲同步化处理根端分生组织细胞，后用电镜技术结合NAMA-Ur特异染色技术、BrUTP短时脉冲标记技术、免疫标记和原位杂交技术对大蒜根端不同时相细胞核仁的超微结构与rRNA基因分布和转录及前体剪切位点进行了研究，主要结果如下：
　　 1.核仁超微结构在各个时期之间变化比较明显，核仁中FC和DFC的数量、大小、形状和分布随着核仁功能的需要，在细胞周期各时相之间高度动态变化。
　　 2.NAMA-Ur特异染色结果显示核仁中的rDNA以两种不同集缩程度存在：致密的染色质块和结构松散的云状DNA。而且rDNA在核仁中的结构形态和分布随时期的不同而变化：在分裂末期以染色质丝伸入早期核仁内部，早G1期只以染色质块的形态分布在FC内部或边缘；晚G1、S和G2期以致密的染色质块和松散的云状DNA分别分布在FC内和DFC，在细胞分裂的前期核仁中rDNA随着FC和DFC的聚缩而相互交织形成网络状；而且DFC区域的云状rDNA分布范围随着核仁所处时期的不同而急剧的变化。
　　 3.用BrUTP结合免疫胶体金技术，脉冲标记同步化后的根端细胞核仁中rRNA基因转录初始产物的合成位置，结果显示G1核仁中标记信号分布在靠近FC的DFC区域，随着细胞周期的进行，S、G2期和早前期核仁中整个DFC区域都有金颗粒的分布，但还是靠近FC的区域金颗粒密集。统计结果表明细胞周期不同时期核仁DFC中转录活动的水平不同。
　　 4.抗核仁纤维蛋白(fibrillarin)抗体免疫标记、U3 snoRNA探针原位杂交实验表明fibrllarin和U3 snoRNA均分布在大蒜细胞核仁DFC区域，GC区域也有部分金颗粒，而FC内金颗粒极少，其平均密度和对照实验核仁内的会颗粒密度相当。说明pre-rRNA前体早期剪切事件发生在核仁的DFC区域，而且不同时期核仁内pre-rRNA剪切活动的位置和强度也不相同；fibrillarin和U3 snoRNA的双标记实验也证明了rRNA前体的早期剪切事件主要发生在靠近FC的DFC区域，而且fibrillarin和U3 snoRNA在核仁中存在着活跃态和储存态两种不同形式。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

一、核仁概述

二、核仁超微结构及其在细胞周期内的动态变化

(一)核仁的超微结构

(二)核仁结构在细胞周期内的变化

三、核仁中核糖体生成主要步骤的发生位置

(一)核仁中rRNA基因的分布

(二)核仁中rRNA基因转录位点的研究

(三)核仁中rRNA前体剪切位点的研究

四、本论文研究的内容和意义

实验材料和方法

一、实验材料

(一)材料

(二)抗体及探针

(三)主要试剂

(四)主要仪器和设备

二、实验方法和步骤

(一)大蒜根端分生组织细胞周期同步化处理和检测

(二)大蒜根端分生组织细胞超薄切片样品的制备

(三)DNA特异染色电子显微镜样品的制备—改进的NAMA-Ur特异染色法

(四)大蒜根端分生细胞BrUTP脉冲标记和免疫胶体金显示

(五)核仁纤维蛋白fibrillarin免疫电镜标记

(六)核仁小分子RNA-U3 snoRNA原位杂交

(七)核仁纤维蛋白fibrillarin和u3 snoRNA双标记

(八)核仁各组分面积测量及金颗粒密度的统计分析

实验结果和分析

一、大蒜根端分生组织细胞的同步化处理及检测结果

二、大蒜根端细胞周期内核仁超微结构的电镜观察

(一)核仁的重建

(二)细胞分裂间期核仁超微结构的变化

(三)核仁在细胞分裂的前期逐步解体

三、大蒜根端分生细胞核仁内rDNA形态分布的电镜观察

(一)核仁形成时rDNA分布形态的变化

(二)核仁内rDNA在细胞分裂间期中分布的变化

(三)核仁解体过程中rDNA状态的变化

(四)不同时期云状DNA纤维在DFC区域分布变化

四、大蒜细胞核仁内rRNA转录位点的免疫标记结果

五、核仁中rRNA前体的剪切位点的研究

(一)核仁内抗fibrillarin单克隆抗体免疫标记结果

(二)核仁小分子RNA-U3 snoRNA电镜原位杂交结果

(三)核仁中fibrillarin和U3 snoRNA共定位的双标记结果

讨 论

一、细胞周期不同时相核仁中超微结构的动态变化

二、关于在细胞周期不同时段核仁中rDNA的动态分布

三、大蒜细胞核仁中rRNA转录发生的位置

四、细胞周期中rRNA前体剪切位点的变化

五、细胞核仁中rRNA基因位置、转录位点和剪切位点的关系

主要结论

参考文献

致 谢

在学期间公开发表论文情况