白色念珠菌热休克蛋白90单克隆抗体的制备及鉴定

摘要

白色念珠菌是一种人和动物的常住型寄生菌,栖生于健康宿主的皮肤和黏膜,只有当宿主的免疫力下降时,才会侵入皮肤粘膜内,进而进入深层组织和血液循环系统,引起系统性感染或称深层念珠菌感染。白色念珠菌本身能分泌和合成大量的毒性分子和免疫调节因子,它们参与真菌的粘附、降解宿主组织蛋白、调节白色念珠菌形态转换等过程。其中某些是白色念珠菌的免疫优势抗原,如热休克蛋白90、天冬氨酸蛋白酶等,它们可诱导机体产生特异性抗体,并在系统性白色念珠菌感染中起着保护作用。
　　 随着癌症患者在肿瘤治疗过程中化疗药物的长期使用,导致了患者免疫力下降,这些患者的白色念珠菌的感染也越来越普遍。现阶段人们预防和治疗白色念珠菌感染主要通过两个环节来进行,诊断和抗真菌治疗。由于该病没有明显的临床症状,加上现阶段临床上人们对真菌的检测主要通过血培养法,而这种检测方法敏感性差、周期性长,导致无法对该病进行有效的早期诊断、预防和治疗,病人的死亡率明显升高,因此如何建立一套白色念珠菌感染的快速检测体系对患者来说将具有重要意义。但抗真菌治疗也存在很多问题,比如真菌的耐药性,人们把解决这一难题寄希望于药物的协同治疗。但抗真菌药物本身的毒性作用再加上它们之间的拮抗作用,使人们把眼光投到了抗体上,单克隆抗体因其特异性高和细胞毒性弱等特点成为抗体中的首选。为了进一步研究白色念珠菌感染的快速检测及抗真菌治疗方法,本研究制备了抗白色念珠菌热休克蛋白90单克隆抗体。
　　 本实验利用pGEX-4T-1Hsp90表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达白色念珠菌热休克蛋白90蛋白,再通过亲和层析法纯化热休克蛋白90重组蛋白,并以热休克蛋白90重组蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠。利用化学融合法将免疫好的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经过HAT、间接ELISA、有限稀释法等一系列方法对杂交瘤细胞进行筛选与纯化,最后通过ELISA和Western-blot方法对杂交瘤细胞分泌出的抗体进行鉴定,我们得到了两株分泌抗白色念珠菌热休克蛋白90杂交瘤细胞系,并制备了抗白色念珠菌热休克蛋白90单克隆抗体,这为我们进一步研究白色念珠菌感染者的快速检测和治疗具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

引言

1 白色念珠菌

1.1 白色念珠菌研究现状

1.2 白色念珠菌热休克蛋白90

2 单克隆抗体

2.1 抗体简述

2.2 单克隆抗体的应用

实验材料与方法

1 实验材料

1.1 实验材料

1.2 实验器材

2 实验方法

2.1 白色念珠菌Hsp90抗原的表达及纯化

2.2 白色念珠菌Hsp90重组蛋白浓度及纯度鉴定

2.3 Western blot鉴定Hsp90重组蛋白的免疫原性

2.4 BALB/c小鼠免疫方案

2.5 细胞融合

2.6 杂交瘤阳性细胞的筛选及亚克隆

2.7 腹水制备

2.8 单克隆抗体的免疫学鉴定

实验结果与分析

1 Hsp90蛋白制备

2 纯化蛋白的免疫原性鉴定

3 BALB/c小鼠的免疫效果分析

4 杂交瘤融合结果

5 杂交瘤特异性鉴定

5.1 SDS-PAGE法对GST蛋白定量分析

5.2 ELISA鉴定单克隆抗体的性质

5.3 单克隆抗体针对抗原的线性与构象型鉴定

5.4 Western blot鉴定单克隆抗体的特异性

讨论

结论

参考文献

致谢

在研期间公开发表文章及参与科研情况