Myosin X在肿瘤侵袭性生长中作用的研究

摘要

丝状伪足是细胞前导缘形成的富含肌动蛋白的指状突起，在游走性细胞移动中起主要作用。丝足延长和数量的增多是细胞定向迁移能力增强的表现。非传统肌球蛋白X(Myosin X，Myo X)是细胞内重要的分子马达，调节细胞丝足的形成，并维持其稳定性。
　　实验室前期工作通过Real-time PCR和Western Blot分别从分子和蛋白水平检测了Myo X在乳腺癌细胞系中的表达。在转移能力强的MDA-MB-231细胞中Myo X高表达;在转移能力弱的MCF-7细胞中低表达。提示Myo X可能与肿瘤的侵袭能力相关。采用FITC-明胶降解实验，发现Myo X在MDA-MB-231细胞降解的细胞外基质处有分布，说明Myo X可能通过形成伪足而参与细胞外基质的降解。用慢病毒载体携带Myo X shRNA侵染MDA-MB-231，沉默内源性MyoX的表达。Matrigel侵袭实验结果表明，沉默了Myo X之后，细胞侵袭能力减弱。
　　本研究利用慢病毒侵染的MDA-MB-231细胞建立荷瘤鼠模型，进一步探讨Myo X对肿瘤侵袭性生长和转移的影响将Scramble shRNA和Myo X shRNA细胞以1.5×106个/只分别接种到裸鼠乳腺脂肪垫(n=5)，细胞接种16天后，接种部位有结节状突起，分别测量小鼠形成的肿瘤的长径(L)和短径(W)并计算肿瘤体积，Scramble shRNA组形成的肿瘤体积为114.66±54.50mm3，Myo XshRNA组形成的肿瘤体积为73.25±38.84mm3。之后隔天测量，4周后处死裸鼠，Scramble shRNA组形成的肿瘤体积为5492.47±1781.23mm3，Myo X shRNA组形成的肿瘤体积为1794.87±786.27mm3，经One-way ANONA统计分析差异具有显著性。将获得的肿瘤石蜡切片行Ki-67免疫组化染色，结果表明Myo X shRNA组Ki-67表达明显减低，与对照组相比具有显著性差异。上述结果表明，沉默了Myo X后，肿瘤的侵袭性生长受到了影响，这种影响可能是因为肿瘤细胞在体内的增殖受到抑制而导致。
　　为了进一步比较Myo X shRNA和Scramble shRNA两组肿瘤细胞肺转移能力，本研究还成功建立了可以量化的自发性肺转移和实验性肺转移动物模型。为研究乳腺癌的转移机制奠定了基础。

目录

声明

摘要

引言

1．1 细胞骨架重排介导的肿瘤侵袭

1．2 MMP与肿瘤侵袭

1．3 肿瘤侵袭相关的信号分子

1．4 肿瘤细胞侵袭与细胞伪足

1．5 Myo X参与细胞丝足的形成

1．6 Myo X参与细胞信号传导

1．7 慢病毒载体介导的基因转染

1．8 肿瘤转移模型

1．9 本文研究的意义和价值

2 材料和方法

2．1 细胞系

2．2 主要试剂及质粒

2．3 主要仪器

2．4 质粒的大量制备

2．5 细胞培养

2．6 慢病毒包装

2．7 免疫荧光染色

2．8 免疫蛋白印记

2．9 荷瘤鼠模型的建立

2．9．1 制备肿瘤细胞悬液

2．9．2 建立乳腺癌肿瘤模型

2．10 肺转移模型的建立

2．10．1 自发性肺转移模型的建立

2．10．2 实验性肺转移模型的建立

2．11 HE染色

2．12 免疫组化染色

2．13 数据处理

3 结果

3．1 慢病毒介导的Myo X shRNA在MDA-MB-231中的表达

3．1．1 获取Myo X shRNA慢病毒颗粒

3．1．2 慢病毒侵染MDA-MB-231细胞

3．2 沉默Myo X影响肿瘤细胞的侵袭特征

3．2 沉默Myo X抑制了肿瘤的侵袭性生长

3．3 沉默Myo X影响了肿瘤细胞的增殖

3．4 自发性肺转移模型

3．5 实验性肺转移模型建立

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢