油茶ACCase基因BC和β-CT亚基的全长cDNA克隆

摘要

油茶是我国南方重要的木本油料之一,所产种子用以榨油,茶油富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸脂肪,含量一般在90％以上,食用茶油有益于人们健康。乙酰辅酶A羧化酶是脂肪酸从头合成的关键酶和限速酶,因此研究油茶的乙酰辅酶A羧化酶基因对于揭示油茶油脂合成规律和油茶的分子育种具有重大意义。本论文主要研究结果如下:
　　 1.油茶BC基因的全长cDNA克隆。以优良无性系‘湘林1号’种子为材料提取RNA,将其反转录的cDNA作为模板,根据其它物种中BC基因保守区域的核苷酸序列,用专业软件Primer Premier5.0设计简并引物,通过简并PCR扩增出BC基因的部分片段,克隆产物经过插入pMD18-T载体,以及转化大肠杆菌DH5α菌株等一系列操作之后送至生物公司测序,根据简并段的cDNA测序结果,设计RACE特异引物,运用RACE技术扩增出两个亚基BC的完整5’端和3’端,这些克隆片断通过VectorNTI9.0等生物信息学软件的分析,相互之间有序的拼接,获得了长度为1901bp的序列。根据拼接得到的序列,为BC设计了三对交错引物,其产物分别对应为A1、A2和A3,BC的三条交错片段A1和A2重叠19bp,A2和A3重叠16bp,最后用A1的上游引物BC JCF1和A3的下游引物BC JCR3扩增出BC的完整CDS,回收克隆片断、克隆、转化及测序,由此得到的测序结果与拼接的BC的全长cDNA序列完全一致,从而获得了油茶BC基因的全长cDNA。
　　 2.油茶β-CT基因的全长cDNA克隆。克隆β-CT基因所采用的技术手段与BC的一样,β-CT基因的简并PCR产物、5'RACE产物以及3’RACE产物分别为725bp、691bp和1375bp,β-CT基因的全长cDNA的长度为1987bp。两个RACE产物之间有重叠区域,设计两对交错引物,其产物分别为B1、B2,两者之间有23bp的重叠区,交错延伸得到所得到的β-CT基因的完整CDS,经过克隆、转化及测序确定其为β-CT基因。
　　 3.油茶BC基因的生物信息学分析。通过生物信息学软件Vector NTI9.0对测序结果进行分析:BC基因cDNA序列长1901bp,含有一个1599bp的ORF,编码533个氨基酸残基；此外还含有长81bp的5端非编码区,长218bp的3端非编码区及一个polyA尾巴；经过在GenBank上的序列比对获知此序列与其它物种的BC基因的同源性达到87％以上,由此确认此序列是油茶的BC基因的全长cDNA序列。根据BC基因的cDNA序列推导的蛋白质序列,应用一系列生物信息学软件对理化性质、高级结构、三维模型等进行预测分析,结果显示该蛋白的等电点pI为6.88,分子量为58509.3Da,两个跨膜结构域,没有信号肽剪接位点,是一个非分泌蛋白。不稳定系数为40.81,是不稳定蛋白；BC蛋白内含有31.33％的α-螺旋,18％的B折叠。模体搜索结果表明在BC上具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、ATP结合位点等多个功能结构域。同源建模的模型中我们可以发现12个明显α-螺旋,整个BC蛋白为一个内凹的结构,这可能与BC能结合生物素的功能相关。
　　 4.油茶β-CT基因的生物信息学分析。β-CT基因cDNA序列长1987bp,含有一个1530bp的ORF,编码510个氨基酸残基；含有长454bp的3端非编码区及polvA尾巴；GenBank上的序列BLAST比对获知此序列与其它物种的β-CT基因的同源性达到87％,因此可确定此序列是油茶的β-CT基因的全长cDNA序列。对β-CT基因cDNA序列推导的蛋白质序列进行生物信息学分析,结果显示β-CT蛋白的等电点pI为5.17,分子量为58077.9Da,两个跨膜结构域,没有信号肽剪接位点,是一个非分泌蛋白。不稳定系数为43.28,是不稳定蛋白；该蛋白内含有27.99％的α-螺旋,17.85％的β-折叠。模体搜索结果表明在β-CT上具有多种N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻磷酸化位点等多个功能结构域。同源建模时发现β-CT前面277个氨基酸的结构没找到合适的模板,部分序列的模型中我们发现了7个明显α-螺旋和5个β-折叠。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

1 绪言

1.1 乙酰辅酶A羧化酶的结构、分类和功能

1.1.1 植物中ACCase的结构和分布

1.1.2 动物中ACCase的结构和分布

1.1.3 ACCase在脂肪合成途径中的作用

1.1.4 ACCase控制植物叶片的碳流量

1.1.5 ACCase在脂肪酸合成反馈调节中的作用

1.1.6 ACCase在其他方面的作用

1.2 ACCase的分子生物学特性

1.2.1 ACCase的酶学性质

1.2.2 ACCase基因的表达与调控

1.3 ACCase基因克隆的研究进展

1.4 ACCase基因工程的研究进展及其应用

1.4.1 提高植物种子的含油量

1.4.2 提高藻类油脂含量基因工程

1.4.3 ACCase对除草剂的敏感性

1.4.4 ACCase在治疗肥胖中的作用

1.5 本研究的目的意义

1.6 本研究的主要内容和技术路线

2 油茶ACCase中BC亚基基因全长cDNA克隆

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器和用品

2.1.4 实验方法

2.2 BC亚基基因全长cDNA克隆与分析

2.2.1 油茶种子胚乳总RNA提取

2.2.2 电泳检测

2.2.3 mRNA反转录获得cDNA

2.2.4 BC亚基的简并PCR

2.2.5 目的片段回收

2.2.6 感受态细胞的制备

2.2.7 T载体重组子的制备

2.2.8 重组子转化

2.2.9 质粒DNA的抽提

2.2.10 PCR鉴定重组子

2.2.11简并PCR产物测序

2.2.12 BC亚基的5'RACE

2.2.13 BC亚基的3'RACE

2.2.14 BC亚基的交错PCR

2.3 BC亚基克隆结果电泳检测

2.3.1 油茶种子总RNA的提取质量

2.3.2 BC亚基简并PCR产物电泳检测

2.3.3 BC亚基5'RACE产物电泳检测

2.3.4 BC亚基3'RACE产物电泳检测

2.3.5 BC亚基交错PCR产物电泳检测

2.3.6 BC亚基全长PCR电泳检测

2.4 BC的生物信息学分析

2.4.1 BC核苷酸序列分析

2.4.2 BC蛋白质序列分析

2.5 讨论

2.5.1 简并PCR

2.5.2 降落PCR

2.5.3 交错延伸PCR

3 油茶ACCase中β-CT亚基基因全长cDNA克隆

3.1 材料和方法

3.2 β-CT亚基基因全长cDNA克隆与分析

3.2.1 油茶胚乳总RNA提取、电泳检测、mRNA反转录

3.2.2 β-CT亚基的简并PCR

3.2.3 β--CT亚基的5'RACE

3.2.4 β-CT亚基的3'RACE

3.2.5 β-CT亚基的交错PCR

3.3 β-CT亚基克隆结果电泳检测

3.3.1 β-CT亚基简并PCR产物电泳检测

3.3.2 β-CT亚基5'RACE产物电泳检测

3.3.3 β-CT亚基3'RACE产物电泳检测

3.3.4 β-CT亚基交错片段电泳检测

3.3.5 β-CT亚基全长PCR电泳检测

3.4 β-CT的生物信息学分析

3.4.1 β-CT核苷酸序列分析

3.4.2 β-CT蛋白质序列分析

3.5 讨论

3.5.1 核苷酸序列分析

3.5.2 氨基酸序列分析

4 结论与创新

4.1 结论

4.2 创新

参考文献

附录 A 实验药品

附录 B 主要仪器设备

附录 C 硕士研究生阶段发表的论文

致谢

课题来源