博白大果油茶遗传多样性的ISSR研究

摘要

博白大果油茶(Camellia gigantocarpa Hu et Huang)是山茶科山茶属常绿乔木，产于广西省博白县。博白大果油茶树形优美，花大果大，其种子含油丰富，是很有价值的观赏植物和油料植物。因森林不断遭到砍伐和破坏，博白大果油茶野生资源数量稀少。本研究首次利用ISSR分子标记对4个博白大果油茶种群进行遗传多样性分析，为合理开发和有效利用博白大果油茶资源提供科学的指导和依据。
　　 本研究采用改良CTAB法、改良SDS法及试剂盒法提取博白大果油茶基因组DNA，进行综合比较后确定提取博白大果油茶DNA的最佳方法是试剂盒法，该方法无论提取博白大果油茶的幼叶还是成熟叶均能得到纯度较高的基因组DNA。
　　 采用单因素实验设计和正交设计对影响PCR反应体系的主要成分及PCR扩增程序进行优化，建立了稳定的、可重复的博白大果油茶ISSR—PCR扩增反应体系：在20ul的反应体系中，Mg2+浓度为2．5mmol/L，模板DNA用量为20ng，Taq DNA聚合酶为1．75U，dNTPs浓度为0．25 mmol/L，引物浓度为0．6 mmol/L。扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，进行35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。
　　 利用最佳ISSR反应体系和扩增程序，从100条引物中筛选出10条多态性高、重复性好的引物，对42个博白大果油茶样品进行ISSR扩增，共扩增出115条清晰可重复的DNA条带，其中98条多态性条带。每个引物可扩增的多态性条带长度范围为220～2000bp，多态性条带数目在7～13条，多态条带百分率为85．22％，说明博白大果油茶存在着丰富的遗传多样性。
　　 通过PopGen32软件统计结果显示，博白大果油茶4个种群间平均有效等位基因数为1．5637，平均Nei’s基因多样性指数为0．3230，平均Shannon信息指数为0．4766，表明博白大果油茶总的遗传多态性较高。4个种群间具有较高的遗传分化(Gst)为0．2949，但仍有70．51％的遗传变异保存于居群内。博白大果油茶4个种群间基因流(Nm)为1．1954，大于1，表明居群间存在一定的基因流动，足以抵制遗传漂变的作用。
　　 根据遗传一致度进行UPGMA聚类得到4个种群的聚类图，结果表明：湖南省新宁县与湖南省植物园聚为一类，他们的亲缘关系最近，遗传一致度为0．8946；广西省博白县那林镇与广西省博白县江宁镇聚为一类，其遗传一致度为0．8836；湖南的两个种群与广西省博白县两种群具有很近的亲缘关系，他们之间的遗传一致度差异仅为0．011，这同时也印证了湖南省新宁县与湖南省植物园的博白大果油茶种群确实引种于广西省博白县。随着全球气候变暖，本来生长于南亚热带地区的博白大果油茶在处于中亚热带的湖南地区也能适应当地的生态环境，产生相应的遗传分化茁壮生长，这为今后尝试将热带亚热带地区的珍稀树种向北引种栽培具有一定的指导意义。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 博白大果油茶的研究概况

1.1 博白大果油茶的简介

1.2 博白大果油茶的分布

1.3 博白大果油茶的栽培与年生长规律

1.4 博白大果油茶的研究进展

1.5 博白大果油茶的应用价值

2 植物遗传多样性的研究

2.1 遗传多样性的概念

2.2 遗传多样性的标记方法

2.3 植物分子标记的种类及比较

3 ISSR分子标记技术研究概况

3.1 ISSR分子标记的原理

3.2 ISSR分子标记的特点

3.3 ISSR分子标记在茶树研究中的应用

4.研究的目的意义、内容与技术路线

4.1 研究的目的意义及内容

4.2 技术路线

第二章 材料与方法

1 材料

1.1 采样点情况

1.2 采样方法

2 主要仪器与试剂

2.1 主要仪器

2.2 主要试剂

2.3 ISSR引物合成与配置

3 实验方法

3.1 博白大果油茶基因组DNA的提取

3.2 博白大果油茶DNA的检测

3.3 ISSR反应体系的建立与正交设计优化

3.4 ISSR-PCR反应程序的优化

3.5 ISSR引物及退火温度筛选

3.6 ISSR-PCR扩增

3.7 数据统计与分析方法

第三章 结果与分析

1 博白大果油茶基因组DNA的提取的和检测

1.1 基因组电泳检测

1.2 紫外分光光度检测

1.3 基因组DNA的ISSR-PCR检测

2 ISSR反应体系的建立与正交设计优化

2.1 ISSR.PCR部分引物的初筛及退火温度的确定

2.2 ISSR反应体系的优化

2.3 ISSR扩增程序的优化

2.4 ISSR最佳反应体系及程序的确定

3 ISSR引物的筛选与退火温度的确定

3.1 ISSR引物的筛选

3.2 ISSR引物与最佳退火温度的确定

4.博白大果油茶遗传多样性的ISSR分析

4.1 ISSR扩增产物的多态性

4.2 博白大果油茶种群的多态性分析

4.3 博白大果油茶ISSR遗传多样性分析

4.4 博白大果油茶种群遗传变异的分析

4.5 遗传一致度与亲缘关系的聚类分析

第四章 讨论

1.不同方法和材料对博白大果油茶基因组DNA提取效果的影响

2.博白大果油茶ISSR反应体系的建立和优化的方法选择

3.博白大果油茶种群的遗传多样性

4.博白大果油茶的聚类分析

5.博白大果油茶保护生物学上的意义

第五章 全文总结

1.主要研究结果

2.创新之处

3.研究展望

参考文献

附录 攻读学位期间的主要学术成果

致谢