用于LM基因检测的基于金纳米信号放大的电化学DNA生物传感器研究

摘要

单增李斯特菌(LM)广泛存在于肉类、乳制品、蔬菜、海产品、冷藏食品及熟食制品等食品中，是仅次于致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌的第四大食源性致病菌。近年来单增李斯特菌引起的食源性疾病在全球范围内频频发生，因此，研究食品中单增李斯特菌的有效检测方法具有重要意义。目前，单增李斯特菌的检测方法主要有传统的分离培养及生化鉴定法、PCR检测法、免疫学检测法等，这些方法基本上都存在检测时间长、操作繁琐、成本昂贵等不足，不适合现场快速测定和大量样本的分析。电化学DNA生物传感器是目前发展起来的可对食品中病原菌基因进行检测的一种方法，具有检测快速、操作简单、成本低、灵敏度高等优点。本文采用循环伏安法、交流阻抗法、差分脉冲伏安法等电化学分析方法构建了两种电化学DNA生物传感器，用于单增李斯特菌hlyA毒理基因片段的检测，主要内容如下: 1.采用柠檬酸钠还原法制备了分散均匀的粒径约15nm的金纳米粒子(AuNPs)。将1，4-苯二甲硫醇(BDMT)作为连接裸金电极与AuNPs的中间物质，制备了层层组装的ssDNA/AuNPs/BDMT/Au电极;将ssDNA/AuNPs/BDMT/Au电极置于6—巯基己醇(MCH)溶液中2h，以封闭电极表面空白位点。分别采用循环伏安法与交流阻抗法表征了各修饰电极的组装过程，表明BDMT、AuNPs、ssDNA、MCH均成功组装到了金电极表面。 2.通过是否对ssDNA/AuNPs/BDMT/Au电极进行6—巯基己醇(MCH)封闭处理，研究了MCH对探针DNA修饰电极的作用。采用交流阻抗法与差分脉冲伏安法对两种杂交后的电极进行表征，结果表明，MCH可封闭电极表面的空白位点，有效调控电极表面的DNA固定密度，减少非特异性吸附的发生，从而提高杂交效率。通过是否在金电极表面组装金纳米粒子，采用交流阻抗测试研究了AuNPs对所制备的生物传感器的放大作用。结果表明，AuNPs能够显著增加电极表面探针DNA分子的固定数量，放大检测信号，并提高电化学DNA生物传感器的检测灵敏度。 3.制备了以道诺霉素(DNR)为杂交指示剂的电化学DNA生物传感器。对DNA的杂交条件进行了优化，结果如下:最适杂交温度40℃;杂交溶液离子强度15mmol/L;杂交时间40min。并对指示剂DNR的嵌入条件进行了优化:最适DNR浓度0.05mmol/L;最佳嵌入时间15min; DNR溶液最适pH值6.5。以差分脉冲伏安法为测试方法，通过对杂交后DNR产生的峰值电流进行分析，实现了目标DNA的定量检测。在目标DNA浓度为1.0×10-13～1.0×10-8mol/L范围内，DNR的峰电流值与目标DNA浓度的对数呈良好线性关系，线性回归方程为I(A)=3.7457+0.1735logC(mol/L)，线性相关系数R2=0.9958，检出限为3.78×10-14mol/L。所制备的电化学DNA生物传感器灵敏度较高，并具有良好的特异性、稳定性（4℃保存一周后的传感器DNR氧化峰电流仅下降约24.8％）与重现性(RSD=2.44％)。 4.制备了无需杂交指示剂的电化学交流阻抗DNA生物传感器。采用交流阻抗技术对探针DNA的固定条件进行了优化，结果如下:最适探针DNA浓度1.5×10-6mol/L;探针DNA固定时间2h;探针DNA固定液最适pH值8.0。并对DNA杂交条件进行了优化:最适杂交温度40℃;杂交时间40min;杂交液离子强度15mmol/L。在DNA溶液浓度为1.0×10-13～1.0×10-7mol/L范围内，杂交信号△Ret(△Ret=Ret(dsDNA)-Ret(ssDNA))与互补DNA浓度的对数呈良好线性关系，线性回归方程为△Ret(kΩ)=75.85+5.76logC(mol/L)，线性相关系数R2=0.9939，检出限为8.33×10-14mol/L。实验结果表明，该电化学交流阻抗DNA生物传感器具有较高的选择性，良好的重现性与稳定性。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 单增李斯特菌概述

1．1．1 单增李斯特菌在食品中的分布及危害

1．1．2 食品中单增李斯特菌的检测现状

1．2 生物传感器概述

1．2．1 生物传感器的发展历程

1．2．2 生物传感器的分类

1．3 纳米金在电化学生物传感器中的应用

1．3．1 在DNA电化学生物传感器中的应用

1．3．2 在电化学酶传感器中的应用

1．3．3 在电化学免疫传感器中的应用

1．4 本课题的研究目的及内容

2 基于BDMT、AuNPs、ssDNA组装金电极表面的电化学研究

2．1 试剂、材料与仪器

2．2 实验方法

2．2．1 溶液的配制

2．2．2 DNA引物的处理

2．2．3 金纳米粒子(AuNPs)的制备

2．2．4 金电极的预处理

2．2．5 ssDNA／AuNPs／BDMT／Au修饰电极的制备

2．3 结果与讨论

2．3．1 金纳米粒子的表征

2．3．2 裸金电极的预处理表征

2．3．3 循环伏安法表征探针DNA的组装及杂交过程

2．3．4 MCH处理的作用

2．3．5 探针DNA在电极表面固定条件的优化

2．4 小结

3 基于道诺霉素杂交指示剂的电化学DNA生物传感器的研究

3．1 试剂、材料与仪器

3．2 实验方法

3．2．1 探针DNA修饰电极的制备

3．2．2 探针DNA的杂交

3．2．3 指示剂的嵌入与电化学检测

3．3 结果与讨论

3．3．1 DNA杂交条件的优化

3．3．2 电化学指示剂DNR的嵌入条件优化

3．3．3 生物传感器的分析性能

3．3．4 传感器韵特异性

3．3．5 传感器的重现性

3．3．6 传感器的稳定性

3．4 小结

4 无杂交指示剂的电化学交流阻抗DNA生物传感器的研究

4．1 试剂、材料与仪器

4．2 实验方法

4．2．1 ssDNA／AuNPs／BDMT／Au电极修饰电极的制备

4．2．2 ssDNA／Au修饰电极的制备

4．2．3 探针DNA的杂交

4．2．4 DNA杂交过程的交流阻抗检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 交流阻抗法表征探针DNA的组装及杂交过程

4．3．2 金纳米粒子的放大作用

4．3．3 探针DNA固定条件的优化

4．3．4 探针DNA杂交条件的优化

4．3．5 交流阻抗生物传感器的线性范围与检出限

4．3．6 传感器的特异性

4．3．7 传感器的重现性、稳定性考察

4．4 小结

5 结论

参考文献

附录 攻读学位期间的主要学术成果

致谢