基于木质纤维产丁醇高产菌株选育及关键酶基因表达分析

摘要

随着全球化石能源的日渐枯竭和快速增长的能源需求，能源资源约束的日益加剧和生态环境问题的不断突出，保障能源安全和发展绿色可再生能源已引起各国政府的高度重视。因此，利用可再生的木质纤维素生物质来生产替代燃料受到了广泛的关注。而生物丁醇作为一种能与汽油以任意比例混和使用甚至替代汽油的可再生清洁能源也迎来了全新的发展机遇。但利用木质纤维生产生物丁醇目前尚存在产量低，原料利用率不高等难题。鉴于此，本研究从菌种的选育出发，以具有广谱碳水化合物发酵能力的糖丁基梭状芽孢杆菌(Clostridium saccharobutylicum) ATCC BAA-117为出发菌株，将基因组改组技术与进化工程育种相结合，进行了适应高浓度杨木水解液的生物丁醇高产菌株的选育，成功获得了株能高效利用杨木水解液发酵高产丁醇的重组进化菌株gsGD-1。同时，对选育菌株gsGD-1利用杨木水解液产丁醇的发酵条件进行了优化，并进一步采用实时荧光定量PCR的方法对出发菌株和改组后高产重组进化菌株gsGD-1之间的丁醇合成酶关键基因表达差异进行了分析。研究内容及取得的主要结果如下:
　　1.建立了用于基因组改组的遗传多样性亲本菌株库。出发菌株Clostridiumsaccharobutylicum ATCC BAA-117经紫外诱变(UV)、核糖体工程育种技术和丁醇耐受性筛选三种方法获得9株能稳定遗传的正向性状菌株，包括丁醇产量高于出发菌株的突变菌6株，分别为UV-1、UV-2、UV-3、RE-1、RE-2和RE-3，其丁醇产量均比原始菌株提高20％以上;丁醇耐受性高于出发菌株的突变株3株，分别为HBT-1、HBT-2和HBT-3，其丁醇耐受性均较原始菌株提高25％以上。这9株菌株组成基因组改组的亲本菌株库，用于后续的递推式原生质体融合实验。
　　2.获得了Clostridium saccharobutlicum原生质体制备、再生和融合的最佳条件。通过单因素实验、中心组合实验设计与响应面分析得到亲本库菌株原生质体制备的最优条件为:菌培养时间为12h，采用溶菌酶的酶浓度为7.11 mg/mL，在酶解温度为39℃条件下，酶解处理1h，糖丁基梭状芽孢杆菌原生质体的制备率与再生率之积达到了50.8％;原生质体融合的最佳条件为:PEG4000的浓度为30％、融合温度为37℃、融合时间为20min和Ca2+浓度为45mM，融合率最高为4.9×10-5。
　　3.利用基因组改组技术选育了2株高产丁醇重组菌株GS3-11和GS3-255。以亲本菌株库的9株菌株进行递推式原生质体融合，经过三轮有效的基因组改组，对获得的融合子进行了抗性平板初筛和摇瓶发酵复筛，获得了2株能稳定遗传的高产和高丁醇耐受性重组菌株GS3-11和GS3-255，在3L发酵罐中进行发酵培养，丁醇的产量分别达到12.51 g/L和12.20g/L，均比出发菌株提高60％以上。
　　4.用进化工程的方法筛选出一株能适应高浓度杨木水解液的进化菌株gsGD-1。首先确定了各菌株在不同杨木水解液浓度下的代时和筛选压力，得出GS3-11的抗高浓度杨木水解液的能力要优于GS3-255。进一步通过在恒定杨木水解液浓度和梯度杨木水解液浓度下对GS3-11进行持续进化培养，发现梯度杨木水解液浓度进化筛选高浓度杨木水解液耐受性菌株效果优于恒定杨木水解液浓度下的进化筛选。筛选得到的进化菌株gsGD-1在杨木水解液中还原糖浓度为60g/L条件下进行摇瓶发酵和3L发酵罐发酵培养，其最大OD值为2.05，生物丁醇的最大产量为10.21g/L，比进化筛选前菌株GS3-11的丁醇最大产量(3.45 g/L)提高196％。
　　5.对进化菌株gsGD-1利用杨木水解液发酵产丁醇的发酵条件进行了优化。通过P-B实验、中心组合实验设计和响应面分析得到gsGD-1发酵产生物丁醇的最优发酵条件为:杨木水解液中还原糖浓度为52.79 g/L，(NH4)2SO43.0 g/L，酵母粉2.54 g/L，CaCO35.43g/L, KH2PO40.75g/L, K2HPO40.81 g/L, MgSO4·7H2O0.2g/L, FeSO4·7H2O0.3 g/L，MnSO40.01 g/L，初始pH7.0，接种量9.7％，装液量76.4％和发酵温度36.5℃。在此优化条件下发酵培养，菌株gsGD-1最大生物丁醇产量为15.64g/L，较优化前(12.57g/L)提高了24.4％，较原始菌株(7.12 g/L)提高了120％。
　　6.对进化菌株gsGD-1和原始菌株丁醇生物合成中关键酶基因的差异表达进行了分析。以管家基因16s rRNA为内参，利用实时荧光定量PCR法检测了原始菌株Clostridium saccharobutylicum ATCC BAA-117与进化菌株gsGD-1在丁醇生物合成过程中产酸中期与产溶剂中期关键酶基因的表达差异。
　　2-ΔΔCt相对定量分析结果表明:
　　(1)进化菌株的产酸基因ack和buk在产酸阶段的表达量均低于原始菌株，约为原始菌株ack和buk基因表达量的65％，而在产溶剂阶段的表达量比原始菌株要高，约为原始菌株的1.5倍。
　　(2)进化菌株的产溶剂基因adhE、aadc、ctfAB和bdhB的表达量在产酸阶段，除aadc变化不明显外，其他三个基因adhE、ctfAB和bdhB的表达量均高于原始菌株，分别为原始菌株的2.67、1.8和1.6倍;在产溶剂阶段的表达量均高于原始菌株，分别为原始菌株的2.51、2.82、10.5和1.34倍。
　　(3)进化菌株与丁醇耐受性相关的基因gldA在产酸阶段的表达量约为原始菌株的40％，在产溶剂阶段gldA的表达量仍然低于原始菌株，约为原始菌株的60％;进化菌株的丁醇耐受性基因hsp90在产酸阶段的表达量略高于原始菌株，在产溶剂阶段hsp90的表达量则为原始菌株1.5倍。可见，进化菌株丁醇产量比原始菌株高，与产溶剂基因的上调表达和与丁醇耐受性相关基因的差异表达（gldA基因的表达下调和hsp90基因的上调表达）有紧密联系。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 生物丁醇概述

1．2 生物法生产丁醇研究进展

1．2．1 生物丁醇生产菌种及改良

1．2．2 丁醇的生物合成途径及代谢调控

1．2．3 生物丁醇发酵原料

1．2．4 丁醇耐受性

1．2．5 木质纤维素原料发酵产丁醇

1．3 基因组改组(Genome shuffling)育种

1．3．1 基因组改组技术

1．3．2 基因组改组育种研究进展

1．4 进化工程育种

1．4．1 进化工程的原理与方法

1．4．2 进化工程育种研究进展

1．5 立题背景与意义

1．5．1 立题背景

1．5．2 立题意义

1．5．3 主要研究内容与技术路线

2 基因组改组亲本菌株库的建立

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验药品与试剂

2．1．4 培养基

2．1．5 培养方法

2．2 方法

2．2．1 紫外诱变

2．2．2 核糖体工程育种

2．2．3 丁醇耐受性筛选

2．2．4 遗传稳定性

2．2．5 分析方法

2．3 实验结果与分析

2．3．1 紫外诱变结果

2．3．2 核糖体工程育种结果

2．3．3 高丁醇耐受性菌株筛选结果

2．3．4 突变株遗传稳定性分析

2．4 本章小结

3 基因组改组选育高产丁醇重组菌

3．1 实验材料

3．1．1 菌种

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验试剂

3．1．4 培养基及溶液

3．2 实验方法

3．2．1 原生质体的制备

3．2．2 原生质体的再生与融合

3．2．3 基因组改组参数的计算

3．2．4 基因组改组

3．3 实验结果与分析

3．3．1 原生质体制备的影响因素

3．3．2 中心组合实验设计优化

3．3．3 响应面模型分析

3．3．4 原生质体制备结果

3．3．5 原生质体融合条件筛选

3．3．6 基因组改组筛选高产丁醇优良菌株

3．3．7 重组菌株的发酵性能稳定性检验

3．4 本章小结

4 重组菌株在高浓度杨木水解液中的进化培养研究

4．1 实验材料

4．1．1 菌种

4．1．2 实验仪器

4．1．3 实验试剂

4．1．4 培养基

4．2 实验方法

4．2．1 选择压力的的确定

4．2．2 菌株代时的确定

4．2．3 恒定杨木水解液浓度下的进化培养

4．2．4 梯度发酵底物浓度下的进化培养

4．2．5 进化菌株的筛选

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 菌株代时的确定

4．3．2 选择压力的确定

4．3．3 进化策略的选择

4．3．4 两种不同底物浓度下调控进化分析

4．4 本章小结

5 进化菌株利用杨木水解液发酵产丁醇条件优化

5．1 材料

5．1．1 菌种

5．1．2 主要实验仪器与试剂

5．1．3 培养基

5．1．4 培养方法

5．2 方法

5．2．1 检测方法

5．2．2 发酵培养基组分Plackett-Burman筛选实验

5．2．3 重要组分中心组合实验设计(CCD)

5．2．4 中心组合实验设计(CCD)优化发酵条件

5．3 实验结果与分析

5．3．1 Plackett-Burman筛选结果

5．3．2 重要组分CCD优化结果

5．3．3 发酵条件CCD响应面优化结果

5．4 本章小结

6 进化菌株丁醇合成途径中关键基因的差异表达研究

6．1 实验材料

6．1．1 样品采集与处理

6．1．2 实验仪器与试剂

6．2 实验方法

6．2．1 总RNA提取

6．2．2 RNA质量检测

6．2．3 实时荧光定量PCR

6．2．4 实验数据分析

6．3 实验结果分析

6．3．1 RNA样品质检结果

6．3．2 进化菌株丁醇生物合成途径中关键酶基因表达分析

6．4 本章小结

7 结论与展望

7．1 主要结论

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

附录

致谢