结肠腺瘤息肉病蛋白APC通过非完整Armadillo重复结构与SMAP蛋白相互作用

摘要

结肠腺瘤息肉病是一种常染色体显性遗传性疾病。致病基因APC位于5q21染色体，整个cDNA编码区长度未8535bp，共有21个外显子，其中第15号外显子非常大，为6571bp。APC基因突变频率较高，大约67％的结肠腺瘤息肉病患者可检测到APC基因的突变。突变的发生不是随机分布而是存在突变热点，生殖细胞突变与体细胞突变分布方式存在一定的差别。点突变大多数为C→T的转变，缺失多发生在有重复的核苷酸序列位置，以5个碱基的缺失最为多见，约占47％。APC蛋白有2843个氨基酸，分子量约为311.6kD。APC蛋白含有多个功能域，参与多种细胞生命活动。总体可分成三个部分：氨基端部分包含两个功能域，寡聚功能结构区和armadillo区；中央部分包含15个氨基酸重复区、20个氨基酸重复区和Axin结合区；羧基端部分含有EB1蛋白结合区域和hDLG结合位点。各个结构域赋予APC蛋白不同的生物学功能。 APC作为一种肿瘤抑制蛋白参与Wnt信号途径，主要是负调控β-catenin胞内水平。APC蛋白与Axin、GSK-3和β-catenin等组成蛋白降解复合物，使β-catenin泛素化并最终降解。APC蛋白可以抑制Wnt信号途径的非正常激活，从而防止结肠癌、黑色素瘤等肿瘤的发生。 APC蛋白的亚细胞定位还存在争论，导致争论的一个关键因素是抗体。APC蛋白商业化抗体较多，已经证实部分抗体存在明显的非特异性反应。利用特异性被证实的抗体发现大部分APC蛋白存在胞浆中。同时利用绿色荧光蛋白标记的方法活体观察APC在爪蟾A6表皮细胞中的运输过程，实验非常清楚地观察到APC蛋白沿微管正向运输到细胞生长区域并定位在质膜皮层下。 APC蛋白与细胞骨架的关系比较复杂，研究报道非常多，有的甚至出现截然相反的结论。在APC蛋白定位过程中，到底是微管起主要作用还是actin骨架网作用更大?这些问题目前也存在争论。通过免疫荧光实验在激光共聚焦显微镜下观察到部分APC蛋白分布微管的末端，用药物处理微管后，APC蛋白不能正常的定位到质膜皮层下，因此微管对APC蛋白的定位中起主要作用。 利用酵母双杂交技术，以APC蛋白500-1600位氨基酸为诱饵，我们从人胎脑cDNA文库中成功筛选到人SMAP蛋白。SMAP是小鼠Kap3在人类中的同源物，共792个氨基酸残基，分子量约为91kD，含有9个armadillo重复结构。我们制备了SMAP蛋白特异性的兔多克隆抗体，首先分析了SMAP蛋白在细胞和组织中的表达情况，证实它是一种广泛表达的蛋白。接着我们又证实SMAP蛋白可以进入细胞核。这些情况都与已报到的SMAP定位情况类似。同时我们在小鼠组织匀浆液中利用免疫沉淀技术证实APC蛋白可以和SMAP蛋白共沉淀。反之，利用商业化的APC抗体也证明了二者可以共沉淀。接下来我们利用免疫激光共聚焦显微镜在未转染MDCK细胞这一自然状态下分析了APC蛋白和SMAP蛋白的亚细胞定位，以及二者与细胞骨架蛋白actin和tubulin共定位情况，证实了APC部分蛋白可以定位在微管的生长末端区域而SMAP蛋白则广泛分布；虽然它们表达模式存在一定差异，但是在细胞生长区突起的地方可以很好的共定位。这也为解释APC蛋白沿微管正向运输并定位膜下皮质区并参与细胞粘附和细胞迁移提供了依据。 我们注意到APC蛋白armadillo重复区域共报道了4个互作蛋白，它们分别是SMAP/Kap3、Asef，PP2A，IQGAP1。我们用的诱饵是APC蛋白的500-1600aa这个片段，而后三者用的都是453-767aa片段。两个片段含有500-767aa的重叠区域，因此我们将这一重叠区域构建到原核表达载体pGEX中。通过免疫沉淀实验证实了500-767aa这个片段的长度足够结合其互作蛋白SMAP。从而证明APC蛋白与SMAP或Kap3的互作并不需要完整的armadillo重复结构域。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

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前言

第一章SMAP和APC蛋白多克隆抗体的制备

第一节SMAP抗体的制备

一材料与方法

二结果

第二节KLH法制备APC多克隆抗体

一材料与方法

二结果

三分析与讨论

四结论

第二章APC和SMAP在组织中的表达和亚细胞定位

一材料与方法

二结果

三分析与讨论

四结论

第三章真核水平证实APC与SMAP相互作用（小鼠组织匀浆液证实互作）

一材料与方法

二结果

三分析与讨论

四结论

第四章细胞免疫荧光观察APC和SMAP共定位

一材料与方法

二结果

三分析与讨论

四结论

第五章体外实验证实APC与SMAP相互作用

一材料与方法

二结果

三分析与讨论

四结论

总结

参考文献

Armadillo蛋白家族

附录

致谢

个人简历