哮喘易感性相关粘附分子编码基因的筛选与功能研究

摘要

目的：支气管哮喘是一类复杂的炎症性疾病，目前对哮喘的易感性机制知之甚少。本室前期研究显示，当损伤因子作用到一定程度，气道上皮受到损伤，其结构完整性遭到破坏以及其功能缺陷，导致局部气道微环境失稳态，可能是气道高反应性疾病的始动因素。在气道高反应或气道炎症发生过程中，气道上皮表达的粘附分子发挥重要的作用，气道上皮细胞通过表达细胞间粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)募集炎症细胞，启动炎症反应；通过其表达的整合素分子将上皮细胞锚定于基膜上，及通过钙粘素维系细胞间的同源粘附，维持上皮的结构和功能完整。因此，本研究假设粘附分子本身缺陷或表达失平衡与哮喘的易感性有关。为求证此假设，本研究①筛选了哮喘患者差异表达粘附分子，通过析因分析选择了2个在哮喘患者中表达下调的粘附分子cateninalpha-like1、integrinbeta4，通过扩增其5’调控区序列，进行了序列变异分析；②观察了cateninalpha-like1、integrinbeta4在人支气管上皮细胞(bronchialepithelialcells，HBECs)中的表达及对HBECs增殖和损伤修复的影响及机制，在细胞和分子水平探讨哮喘的易感性机制。 方法：①提取哮喘患者外周血白细胞，抽提mRNA，逆转录，生物素-16-dUTP标记，获得cDNA探针，cDNA探针和人细胞外基质与粘附分子基因芯片杂交，结果用软件进行分析统计，筛选差异表达粘附分子。②PCR扩增哮喘患者表达下调的cateninalpha-like1、Integrinbeta4基因5’调控区，进行正反双向测序及序列变异分析。③原位杂交法观察HBECs中cateninalpha-like1、integrinbeta4的表达。④建立HBECs损伤修复指数测定方法，观察cateninalpha-like1、integrinbeta4反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASO)对细胞损伤修复及增殖的影响。⑤观察cateninalpha-like1、integrinbeta4在纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)启动的HBECs损伤修复及增殖中的作用。⑥用Westernblot技术检测与细胞迁移活动相关的粘附斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)磷酸化，初步探讨cateninalpha-like1、integrinbeta4参与上皮细胞修复活动的机制。 结果：①哮喘易感性相关粘附分子表达谱研究：cDNA微阵列显示哮喘患者组与正常人组比较上调的粘附分子基因有15个，分别是Integrinalpha4、alphaL、alphaM、alphaV、beta1、beta8、NCAM1、P-selectin、FGB、THBS3、MMP24、TPA、Heparanase、PAI-1、PAI-2；下调的基因有integrinbeta4、cateninalpha-like1、VCAM、Vitronectin、uPA、TIMP-1共6个。析因分析显示，integrinbeta4、cateninalpha-like1两种分子的表达下调与哮喘易感性密切相关。②Cateninalpha-like1及integrinbeta4基因突变研究：在所有已测样本的cateninalpha-like15’调控区转录起始位点上游902bp范围内未发现基因变异，尚不能证实cateninalpha-like1在哮喘患者表达下调与基因变异有关。Integrinbeta4序列分析发现，哮喘患者的-nt840、-nt839、-nt822、-nt821由A突变为C，提示哮喘患者5’调控区存在基因变异，该变异可能与基因的表达下调有关。③HBECs中cateninalpha-like1及integrinbeta4的表达：细胞爬片原位杂交观察到未受臭氧应激的HBECs中cateninalpha-like1阳性细胞数较少，而臭氧攻击组较未受臭氧攻击组，阳性细胞数明显增多。Integrinbeta4在未受臭氧应激组有较明显的杂交信号，臭氧攻击后，阳性信号减弱，提示此两种分子的表达参与HBECs的应激反应应答。④cateninalpha-like1ASO及integrinbeta4ASO对HBECs损伤修复及增殖的影响：结果显示cateninalpha-like1ASO、integrinbeta4ASO明显抑制HBECs的损伤修复及增殖。⑤cateninalpha-like1及integrinbeta4对Fn促HBECs损伤修复及增殖的介导作用观察：检测结果显示，Fn有较强的促损伤修复及促增殖能力，其效应可被酪氨酸激酶途径抑制剂Genestin阻断。Integrinbeta4ASO预处理可抑制Fn的促损伤修复，但对Fn促细胞增殖能力无明显影响。Cateninalpha-like1ASO处理可抑制Fn的促损伤修复及促增殖效应。⑥cateninalpha-like1及integrinbeta4表达对FAK磷酸化的影响：检测结果显示，Fn可促进FAK磷酸化，并在30分钟达到高峰，Fn的效应可被Genestin阻断，cateninalpha-like1可抑制Fn的促FAK磷酸化效应。 结论：哮喘患者组多个粘附分子的表达出现异常变化。哮喘病人integrinbeta45’调控区基因序列-nt840、-nt839、-nt822、-nt821存在变异，由A变异为C。HBECs可表达cateninalpha-like1及integrinbeta4，cateninalpha-like1及integrinbeta4促进HBECs的损伤修复及增殖，并参与Fn促HBECs的损伤修复过程，但cateninalpha-like1及integrinbeta4在参与Fn促上皮增殖过程中存在不同的效应。粘附分子与Fn结合后，可促进FAK磷酸化，呈一过性时效关系，该效应可被Genestin阻断，其中cateninalpha-like1参与Fn的FAK磷酸化信号传递效应，而integrinbeta4可能存在其它的信号传递途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

第一章前言

第二章哮喘易感性相关粘附分子筛选及其编码基因变异分析

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

2.4附图

第三章达式Catenin alpha-like 1在HBECs损伤修复中的作用及机制研究

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

3.4附图

第四章 Integrin beta 4在HBECs损伤修复中的作用及机制研究

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

4.4附图

第五章结论

第六章 综述 粘附分子表达与哮喘气道炎症

6.1粘附分子

6.2粘附分子对炎症细胞的募集作用

6.3粘附分子在支气管哮喘中的作用

第七章参考文献

第八章附录1

第八章附录2

第八章附录3

第八章附录4

第八章附录5

第八章附录6

第八章附录7

致谢

攻读学位期间主要研究成果