U251细胞系中肿瘤干细胞的分离、培养、鉴定及原位移植瘤模型的建立

摘要

目的：本研究旨在从U251细胞系中分离、培养和鉴定脑肿瘤干细胞，观察其生长特征，并初步比较它们和人胚胎神经干细胞的异同。建立以U251细胞系来源的脑肿瘤干细胞为移植物的动物模型。为脑肿瘤干细胞的进一步研究打下基础。 方法：应用简化的无血清培养基和悬浮培养法培养U25l细胞，并将获得的脑肿瘤干细胞接种于含血清培养基中观察其分化；交替用含血清培基和无血清培基培养U251细胞，观察其生长特性；利用人胚胎海马组织分离和培养神经干细胞作为对照，观察神经干细胞和脑肿瘤干细胞在各方面的异同；用含DMSO的冻存液和液氮冷冻保存脑肿瘤干细胞；利用BrdU掺入实验检测脑肿瘤干细胞在形成克隆性细胞团过程中的增殖情况；用免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞在诱导分化前后表达神经干细胞标志物CDl33、Nestin和成熟神经细胞表型NeuN、NSE、GFAP、CNPase的情况；利用免疫磁珠分选方法分离原代肿瘤细胞中的CDl33阳性细胞，以观察CDl33阳性和阴性肿瘤细胞在体外增殖；通过将脑肿瘤干细胞移植入BALB／c裸鼠颅内的方法建立原位移植瘤模型。 结果：U251细胞接种至无血清培养基后，部分细胞能够存活并增殖为悬浮生长细胞球，并具有很强的自我更新和增殖能力；这种悬浮生长的细胞转移到含血清培基中后可贴壁分化；U251细胞在含血清培基和无血清培基中交替培养时能够快速转换生长方式；可以通过细胞冻存与复苏技术长期保存脑肿瘤干细胞，但对细胞活力有影响；脑肿瘤干细胞与神经干细胞有很多相似性，但也在增殖能力、分化的细胞种类等方面存在明显区别；脑肿瘤干细胞中CDl33和Nestin表达阳性，肿瘤干细胞球中的部分细胞和肿瘤干细胞的分化肿瘤细胞均可以具有神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的表型；以CDl33为标志物，利用免疫磁珠细胞分离技术可以获得纯度较高的、具有体外增殖的脑肿瘤干细胞；脑肿瘤干细胞可以在裸鼠颅内导致肿瘤发生。 结论：U251人胶质瘤细胞系中含一定比例脑肿瘤干细胞，此种细胞可在体外分离，培养和诱导分化；脑肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化能力；脑肿瘤干细胞裸鼠颅内原位移植法是一种新的建立肿瘤模型的方法；脑肿瘤干细胞的发现可能将为脑肿瘤研究提供全新的思路。

目录

文摘

英文文摘

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前言

第一章U251细胞系中脑肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定 引言

第一章U251细胞系中脑肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定 材料与方法

第一章U251细胞系中脑肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定 结果

第一章U251细胞系中脑肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定 讨论

第一章U251细胞系中脑肿瘤干细胞的分离、培养及鉴定 附图

第二章脑肿瘤干细胞原位移植瘤动物膜型的建立 引言

第二章脑肿瘤干细胞原位移植瘤动物膜型的建立 材料与方法

第二章脑肿瘤干细胞原位移植瘤动物膜型的建立 结果

第二章脑肿瘤干细胞原位移植瘤动物膜型的建立 讨论

第二章脑肿瘤干细胞原位移植瘤动物膜型的建立 附图

结论

参考文献

综述 脑肿瘤干细胞及其原位至瘤模型

致谢

攻读学位期间主要研究成果