人巨细胞病毒UL123基因的克隆、表达和细菌双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

摘要

目的：在IMPACT-TWIN蛋白纯化系统中克隆和表达人巨细胞病毒(HCMV)ULl23基因(iel)外显子4(iel-exon4)及其cDNA全长，并对表达产物进行鉴定；在细菌双杂交系统中克隆和表达HCMViel-exon2，3及iel-exon4，构建细菌双杂交诱饵质粒，对表达产物进行鉴定，并进行转化子自身激活作用鉴定。 方法：①提取感染了HCMV AD<,169>的人胚肺成纤维细胞(HEL)的DNA和RNA，以DNA和RNA为模板，分别用PCR和RT-PCR扩增iel-exon4和iel cDNA全长，再分别克隆入原核表达载体pTWINl上intein2的N端，转化E.coli ER 2566，经PCR、限制性酶切和测序鉴定阳性重组子，在低温和低IPTG浓度下诱导重组子表达可溶性重组融合蛋白rIEl-C<,86-491>／intein2和rIEl／intein2，用SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定。②以重组质粒pTWINl／iel为模板扩增iel-exon2，3和iel-exon4，分别克隆入pBT质粒上入CI的C端，转化E.coli XLl-Blue MRF’Kan，经PCR、限制性酶切和测序鉴定阳性重组子，提取阳性重组质粒，再转化入细菌双杂交系统报告菌株，在30℃和低IPTG浓度下诱导重组子表达可溶性重组融合蛋白rIEl一N<,85>／λC1和rIEI-C<,86-49l>／λC1，用SDS-PAGE和Western Blot对表达产物进行鉴定，并进一步鉴定重组子自身激活作用。 结果：①成功构建了重组质粒pTWINl／iel-exon4和pTWINl／iel，并在E.coli ER 2566中分别高效表达了重组融合蛋白rIEl-C<,86-491>／intein2和rIEl／intein2。②细菌双杂交诱饵质粒pBT／iel-exon2,3和pBT／iel-exon4构建成功，并在报告菌株中分别表达了重组融合蛋白rIEl-N<,85>／λC1和rIEl-C<,86-491>／λC1，且pBT／iel-exon2，3和pBT／iel-exon4均无自身激活作用。 结论：在IMPACT-TWIN蛋白纯化系统中成功克隆并表达了HcMvlel-exon4和iel cDNA全长，为制备HCMV IEl特异性抗原奠定了基础；在细菌双杂交系统中成功构建了无自激活作用的诱饵质粒pBT／iel-exon2,3和pBT／iel-exon4，可用于筛选文库。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

第一章前言

第二章材料与方法

第三章实验结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

综述 人巨细胞病毒立即早期蛋白功能的研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果