脐血内皮细胞对脐血CD34细胞体外扩增及其归巢能力的影响

摘要

目的：观察脐血内皮细胞联合细胞因子对脐血CD34<'+>细胞的扩增作用，比较脐血内皮细胞联合细胞因子接触培养和非接触培养对脐血CD34<'+>细胞的扩增作用。 方法： 1．脐血内皮细胞(CBEC)的培养及纯化 分离脐血单个核细胞(MNC)，将其加入内皮细胞选择性培养体系中。培养14天后通过vWF相关抗原、CD31抗原、CDl44抗原、UEA抗原，利用ABC免疫组化试剂盒检测内皮细胞纯度。荧光显微镜下观察脐血内皮细胞对Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)摄取情况。 2．免疫磁珠法分选脐血CD34<'+>细胞 MiniMACS免疫磁珠分选脐血CD34<'+>细胞，并用流式细胞仪分析分选后CD34<'+>细胞的纯度。 3．脐血内皮细胞对脐血CD34<'+>细胞的扩增作用 根据培养体系不同，实验分为四组：(1)对照组(contro1)，未扩增的CD34<'+>细胞；(2)细胞因子组(CKs)，将脐CD34<'+>细胞接种到细胞因子组合(rhSCF，rhlL3，rhlL-6，rhGM-CSF)培养体系中；(3)接触培养组(contact，Con)，先将脐血CD34<'+>细胞接种到细胞因子组合培养体系中，再直接加在贴壁的亚融合脐血内皮细胞上，接触内皮细胞培养；(4)非接触培养组(noncontact，Non)，先将脐血CD34<'+>细胞接种到细胞因子组合培养体系中，再将其放在Millicell(0.4pro，Millipower)上部小室内，最后把Millicell放在亚融合脐血内皮细胞上，从而使内皮细胞和CD34<'+>细胞隔离非接触内皮细胞培养。培养7天后，收集各组非贴壁细胞，统计有核细胞数及有核细胞数中CD34<'+>细胞数，半固体集落培养检测扩增后造血细胞中CFU-GM,CFU-E,BFU-E,HPP-CFC的含量。 结果： 经ABC免疫组化试剂盒检测，脐血内皮细胞vWF抗原、CD31抗原、UEA抗原表达均呈强阳性，CDl44抗原表达呈阳性。流式细胞仪检测扩增前MNC中CD34<'+>细胞阳性率3.3％士1.2％(n=3)，MninMACS分选获得的阳性细胞中CD34<'+>细胞达到96.75％士1.3％(n=5)；分选获得的阴性细胞中CD34<'+>细胞为2.2％士1.0％(n=3)。扩增7天后各组CD34<'+>细胞阳性率分别为：CKs组18.3[％]士5.67％；Con组19.37[％]士5.8％；Non组20.4％士5.1％。以脐血CD34<'+>细胞扩增培养前(Control)的细胞总数，CD34<'+>细胞数，集落生成数为对照，计算扩增7天后CKs组、Con组和Non组的有核细胞数，CD34<'+>细胞数，CFU-GM, CFU-E，BFU-E，HPP-CFC的扩增倍数。结果显示：CKs组有核细胞数，CD34<'+>细胞，CFU-GM，CFU-E，BFU-E，HPP-CFC的扩增倍数分别为：28.6士8.0，5.17士1.6，8.58士4.2，2.84士1.2，6.7士1.6，3.6士0.8：Con组的扩增倍数分别为：55.1+3.3，10.74士2.6，32.25士1.8，5.37士1.3，8.31士1.7，19.1士7.2；Non组的扩增倍数分别为：27.5士7.3，8.67士2.2，20.2士6.1，3.32士1.8，10.31士1.2，7.6士2.9。 结论： 1．建立了诱导脐血单个核细胞为内皮细胞的培养体系，诱导培养14天后，免疫组织化学显示内皮细胞vWF抗原、CD31抗原、UEA抗原表达均呈强阳性，CD144抗原表达呈阳性；免疫荧光显示内皮细胞具有吞噬功能。 2．脐血内皮细胞联合细胞因子接触培养和非接触培养均可以扩增早期造血细胞，但接触培养组对早期造血细胞的扩增作用显著优于非接触组。 目的：比较扩增前后造血细胞CXCR4、CDlla和CD49d的表达水平以及CXCR<'4+>、CDll<'a+>和CD49<'d+>细胞扩增倍数；比较扩增前后造血细胞自然黏附率和迁移率。 方法： 1．实验分组同第一部分。流式细胞仪检测扩增前后造血细胞CXCR4、CDlla和CD49d表达水平。将Control组阳性细胞数定为1，比较各组CXCR<'4+>、CDll<'a+>和CD49<'d+>细胞扩增倍数。 2．黏附实验 MTT比色法测定扩增前后各组细胞与纤维连接蛋白(FN)及小鼠骨髓内皮细胞株(mBMEC)孵育后黏附细胞的A<,570>值，从而计算扩增前后各组细胞与FN及mBMEC自然黏附率。收集自然黏附实验中黏附细胞和未黏附细胞做CFU-GM培养，统计黏附细胞和未黏附细胞中CFU-GM含量之比，检测黏附细胞CFU-GM形成能力。 3．迁移实验 通过mBMEC诱导各组造血细胞穿过Millicell(8μm)滤膜来检测扩增前后造血细胞迁移率。将Control组的迁移率定为100，CKs组、Con组和Non组绝对迁移率分别与Control组绝对迁移率比较得出各组相对迁移率。 结果： 扩增7天后，与Control组比较CKs组造血细胞CXCR4表达下调，而Con组和Non组造血细胞CXCR4表达上调；Control组造血细胞CD49d表达下调，Con组和Non组CD49d表达无明显变化：Cks组、Con组和Non组造血细胞CDlla表达均无明显变化，仍保持Control组的水平。扩增7天后CKs组、Con组和Non组的CXCR4<'+>细胞数、CDlla<'+>细胞数和CD49d<'+>细胞数都得到了不同程度扩增，均显著大于Control组；其中Con组CXCR4<'+>细胞数、CDlla<'+>细胞数扩增倍数最大，分别扩增了58.13±2.19倍和53.56±2.63倍。 扩增7天后各组造血细胞与FN自然黏附率显示：Con组(49.975％±2.O％)和Non组(39.63％±8.7％)均高于Control组(19.95％±8.8％)和CKs组(20.49％±8.7％)。扩增7天后各组造血细胞与mBMEC自然黏附率显示：Con组(76.13％±13.6％)和Non组(55.33％±3.O％)与mBMEC的自然黏附率均高于CKs组f23.80％±11.3％)和Control组(30.87％±4.2％)。Con组和Non组黏附细胞CFU-GM形成能力大于CKs组和Control组。Con组和Non组迁移率明显高于CKs组和Control组。 结论： 1．脐血内皮细胞联合细胞因子可以改善细胞因子对造血细胞CXCR4表达下调作用，并且显著扩增CXCR4<'+>、CDlla<'+>和CD49d<'+>细胞。 2．脐血内皮细胞联合细胞因子显著增加脐血造血细胞的自然黏附率、迁移率及黏附细胞CFU-GM形成能力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

原创性声明及关于学位论文使用授权说明

第一部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞的扩增作用 第一章 前言

第一部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞的扩增作用 第二章 材料与方法

第一部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞的扩增作用 第三章 结果

第一部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞的扩增作用 第四章 讨论

第一部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞的扩增作用 第五章 结论

第二部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞扩增后归巢能力的影响 第一章 前言

第二部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞扩增后归巢能力的影响 第二章 材料与方法

第二部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞扩增后归巢能力的影响 第三章 结果

第二部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞扩增后归巢能力的影响 第四章 讨论

第二部分 脐血内皮细胞对脐血CD34+细胞扩增后归巢能力的影响 第五章 结论

内皮细胞与造血细胞的研究进展

参考文献

附图

致谢

攻读硕士期间主要研究成果