GADA、IA-2A微量平板放射结合检测法的建立与临床应用

摘要

背景： 1型糖尿病(T1DM)患者或前期个体血清中存在多种自身抗体，采用放射配体法(RLA)检测谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)和蛋白酪氨酸磷酸酶-2自身抗体(IA-2A)能正确指导T1DM分型与治疗，同时也能有效预测TIDM的发生。然而RLA不易于自动化和不适应于大样本的检测，且检测成本偏高，临床应用受到限制。 目的： 建立GADA、IA-2A微量平板放射结合检测法(RBA)，初步评价其临床应用价值。尝试采用该法检测末梢血中GADA和IA-2A，为今后应用于TIDM的筛查和预测提供基础，并降低检测成本。 方法： 1.方法建立采用重组人GAD65(或IA-2)质粒，经试管内转录与翻译，获得35S-GAD65抗原(35S-IA-2抗原)。经Sephadex G-25柱纯化并稀释的35S-GAD65抗原(35S-IA-2抗原)与2μl血清在V形底96孔平板中缓慢振荡孵育24h，而后转入已包被蛋白A的Millipore平板中。采用4℃ PBS缓冲液洗涤抗原抗体复合物。并采用多功能液体闪烁发光仪计数，结果以WHO标准单位表示。 2.检测条件优化分析固定其他检测条件不变，分别对标记抗原的纯化方式、加入的放射性计数值、血清与标记抗原孵育时间、沉淀物洗涤次数和闪烁液型号的选择进行优化分析。 3.方法评价对方法的变异情况、重复性、线性与检测限、回收率等进行评估；盲法检测由美国疾病预防控制中心(CDC)提供的150例DASP 2005标本评价方法的灵敏度和特异性；评价脂血、黄疸以及溶血对检测结果的影响；评价其他自身免疫疾病(Graves病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等)对检测结果的交叉反应；与经典RLA法比较，评价方法的一致性。 4.临床应用检N224例正常人GADA和IA-2A浓度，确定阳性阈值。并检测162例TIDM和210例新诊T2DM患者GADA和IA-2A浓度，评估临床应用效果。 5.末梢血检测对35例TIDM患者、24例T2DM患者和32例正常人同时采集静脉血和手指血，比较检测结果的一致性。 6.成本分析对微量平板RBA法与经典RLA法检测成本进行比较。 结果： 1.优化的检测条件包括采Sephadex G-25柱凝胶过滤层析法纯化标记抗原，2μl血清与放射性计数为3×104标记抗原缓慢振荡孵育24h，采用4℃PBS缓冲液洗涤沉淀物10次，以及采用OptiphaseSupermix型闪烁液进行放射性计数。 2.该法检测GADA批内CV为3.8％～10.2％，批间CV 5.6％～11.9％。检测IA-2A批内CV为4.1％～10.0％，批间CV 5.7％～12.8％：间隔1月的3次重复检测，GADA和IA-2A浓度差异无显著性(P均>0.05)，所测标本阴、阳性结果判断完全一致；WHO标准品浓度在15.63～250 IU/ml范围内，血清样品GADA在40.3～664 IU/ml，IA-2a在53-848 IU/ml范围内线性良好。GADA检测限为3.6IU/ml，IA-2A检测限为0.54 IU/ml；该法检NGADA回收率为71.9％～122.8％，IA-2A回收率为72.0％-133.3％；DASP 2005结果显示，检测GADA灵敏度为78％，特异性为98％。检测IA-2A灵敏度为72％，特异性为98％；血清标本TG浓度≤5.8mmol/L，TBIL浓度≤67.1μmol/L，血浆中Hb浓度≤5.3g/L下，对GADA和IA-2A检测结果无显著影响；交叉反应显示，50例Graves病患者中GADA阳性2例，12例系统性红斑狼疮患者GADA阳性1例，20例类风湿因子阳性的风湿性关节炎患者中GADA阳性1例。IA-2A在上述3种自身免疫性疾病中均未检测出阳性；微量平板RBA检测GADA与经典RLA法结果判定一致率97.5％，Kappa值0.95；检测IA-2A与经典RLA法结果判定一致率96.5％，Kappa值0.92。 3.该法检测GADA和IA-2A阳性阈值分别为40.0 IU/ml和9.2IU/ml(均为224例正常人的99％百分位点)；检测T1DM患者GADA阳性率为46.9％，明显高于正常人的0.89％(P<0.001)。检测T1DM患者IA-2A阳性率22.8％，也明显高于正常人的0.89％(P<0.001)；检测T2DM患者GADA阳性率为5.2％，显著高于正常人的0.89％(P<0.01)。而IA-2A在T2DM患者中阳性率2.4％，与正常人相比，差异无显著性(P>0.05)。 4.微量平板RBA法检测手指血GADA与经典RLA法检测静脉血结果判定一致率96.7％，Kappa值0.905。检测IA-2A结果判定一致率100％；微量平板RBA法检测手指血与静脉血GADA和IA-2A结果判定一致率均为100％。 5.微量平板RBA法检测单例抗体标本试剂成本为34.73元，较经典RLA法节约了成本19.69元。 结论： 建立的微量平板RBA法灵敏度、特异性、重复性好，与经典RLA法一致性高，临床初步应用效果良好，能适用于末梢血的检测，易于自动化且降低检测成本，具有较好的临床应用价值。

目录

文摘

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论文说明:缩略语一览表

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第一章前言

第二章对象与方法

第三章结果

3.1检测条件优化分析

3.2方法评价

3.3临床应用

3.4末梢血检测

3.5微量平板RBA法与经典RLA法检测试剂(耗材)成本比较

第四章讨论

第五章结论

第六章参考文献

综述一 胰岛自身抗体检测及其标准化研究进展

综述二 胰岛自身抗体异质性研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果