蛋白酶体抑制剂MG132对宫颈癌Hela细胞凋亡及其caspase-3表达的影响

摘要

目的：探讨蛋白酶体抑制剂MG132对Hela细胞凋亡及其caspase-3表达的影响。 方法：采用对数生长期人宫颈癌Hela细胞进行实验。实验组予以不同浓度MG132干预，对照组则不加MG132。 1.倒置显微镜观察对照组及终浓度为10μmol/L MG132处理组Hela细胞生长情况。 2.丫啶橙联合溴化乙锭双染，荧光显微镜观察对照组及终浓度为10μmol/L MG132处理组Hela细胞培养48h后细胞形态和染色变化。 3.电镜观察对照组及终浓度为10μmol/L MG132处理组Hela细胞培养48h后的超微结构。 4.对照组及终浓度为10 μmol/L MG132处理组Hela细胞培养48h后，抽提Hela细胞DNA，对DNA裂解片段凝胶电泳。 5.对照组及终浓度为2.5、5、10、20 μmol/L MG132作用组Hela细胞培养48h后，PI单染流式细胞仪分析Hela细胞凋亡百分率。对照组及终浓度为10μmol/L MG132作用组Hela细胞培养24、48、72h后检测细胞凋亡率和细胞周期变化。 6.免疫细胞化学SABC法检测对照组及不同浓度MG132作用组Hela细胞48h后，图像分析软件(IPP)量化测量细胞中caspase-3蛋白的表达情况，用各浓度组细胞的平均积分光密度(IOD)表示。 结果：1.倒置显微镜下观察到对照组Hela细胞伸展良好，呈梭形及多角形，细胞数量多，细胞接触紧密。MG132处理后大多数Hela细胞缩小变圆，细胞膜出泡，部分细胞脱壁，细胞间间隙增宽，凋亡细胞明显增多。 2.丫啶橙(A0)联合溴化乙锭(EB)双染显示：对照组Hela细胞呈绿色均匀荧光，细胞圆形均匀。实验组可见部分Hela细胞核染色质凝聚、固缩或断裂，呈致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色颗粒，部分带弱桔红荧光，呈凋亡细胞表现，偶见强橘红色死细胞。 3.透射电镜观察：实验组部分出现细胞凋亡的典型形态学特征：细胞体积变小，细胞膜皱缩，胞核固缩，染色质固化、边集化，密度增高，帽状附于核膜，可见细胞凋亡小体。 4.DNA裂解片段凝胶电泳分析：对照组DNA条带集中在样品孔附近，实验组出现明显“阶梯状”条带。 5.流式细胞仪检测显示：对照组及经终浓度为2.5、5、10、20μ mol/L MG132处理Hela细胞48h后，Hela细胞的凋亡率逐渐升高，分别为0.96％，7.47％，12.15％，19.35％，28.94％，任意两组间比较差异显著(P<0.001)。对照组及经10μmol/L MG132处理Hela细胞24、48、72h后，与对照组相比，G2/M期Hela细胞所占比例改变，以48h所占比例最高，而凋亡率随MG132作用时间延长而升高。 6.经不同浓度MG132处理后Hela细胞中caspase-3蛋白的表达呈阳性，各浓度组单个细胞平均积分光密度(IOD)值经统计软件处理显示任意两组间蛋白表达水平差异显著(P<0.001)。 结论：1.MG132能够诱导Hela细胞凋亡，呈剂量一时间依赖性。MG132使Hela细胞阻滞在G2/M期。 2.MG132作用后Hela细胞caspase-3蛋白表达上调，提示caspase-3参与了MG132诱导的Hela细胞凋亡。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

前言

第一章材料与方法

1材料与仪器

2主要试剂和药物的配制

3方法

4统计学方法

第二章结果

1倒置显微镜观察Hela细胞生长变化情况

2 AO/EB双染检测Hela细胞经MG132作用后凋亡情况

3透射电镜结果

4 DNA裂解片段琼脂糖凝胶电泳分析

5 Hela细胞凋亡的流式细胞仪分析

6 MG132处理前后Hela细胞中caspase-3蛋白表达的变化

第三章讨论

第四章结论

参考文献

综述

致谢