缺氧诱导因子1α基因克隆及HIF-1α-pcDNA3.1表达研究

摘要

冠心病(Coronary Heart Disease，CHD)是一种心肌缺血、缺氧性心脏病，其发病率高，死亡率高，严重危害着人类的身体健康。在我国，冠心病的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，己成为当前危害人民身体健康的最主要因素之一。目前冠心病的治疗方法主要有药物治疗、手术治疗和介入治疗等。但是由于心肌细胞是终末分化的细胞，不能再生，上述疗法无法促使梗死的心肌再生，使心肌梗死患者的远期预后不能得到显著改善，因此寻求一种新的更好的治疗手段能够修复与再生坏死心肌细胞，阻止或延缓心室重构和心功能衰竭发生已成为近年临床研究的迫切需求。基因治疗(血管新生疗法)和细胞治疗(细胞心肌成形术)作为全新的治疗手段，成为当前心血管领域的研究热点。 缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是细胞在缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白，由于HIF-1不仅可以促进多种血管生成因子及其受体的转录表达，增加血管再生，提高血流灌注，挽救濒死缺氧的心肌细胞。而且，它还可以提高缺血心肌对缺氧环境的适应性，增强酵解过程，为心肌提供更多的能量代谢。因此可以设想，HIF-1基因的治疗效果会明显强于单纯VEGF或FGF。治疗。细胞治疗主要是指将具有分化潜能的自体或异体细胞移植入机体组织，在一定条件下使移植的细胞分化为所需类型的组织细胞，起到修复组织、恢复器官功能的作用。由此，我们设想如能将HIF-1基因转入靶细胞中，并获得有效的表达，再把携带外源性HIF-1基因的细胞移植到心梗区，就有可能起到基因或细胞治疗二者相互协同、相互促进的作用；其效果可能优于单用。 本实验分为两个部分。第一部分：HIF-1α基因克隆及HIF-1α-pcDNA3.1载体的构建。第二部分：将IJIF-1α-pcDNA3.1表达载体转染Hela细胞。 第一部分：HIF-1α基因克隆及HIF-1α-pcDNA3.1载体的构建 目的：将ItlF-1α基因构建到pcDNA3.1真核表达载体中，并测序证实。 方法：抽提大鼠心肌细胞mRNA，以mRNA为模版，逆转录得到cDNA，PCR扩增HIF-1α目的基因，连接到pGEM-T载体中，酶切，测序证实，双酶切将HIF-1 α转至pcDNA3.1中。 结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示RT-PCR扩增出的特异片段约2480bp，基因测序结果与GenBank报道的完全一致，结果成功构建了HIF-1α-pcDNA3.1真核表达载体。 结论：成功将HIF-1α基因构建到pcDNA3.1真核表达载体中，经测序检测无碱基改变。 第二部分：HIF-1α-pcDNA3.1表达载体转染Hela细胞研究 目的：将构建的HIF-1α-pcDNA3.1真核表达载体，在宫颈癌细胞(Hela、)中进行表达并检测其蛋白表达。 方法：采用阳离子脂质体法将载体转入Hela细胞，观察HIF-1αmRNA的表达情况，然后分别用荧光染色和Western Blot等方法检测证实转染的有效性。 结果：质粒HIF-1α-pcDNA3.1转染Hela，细胞24h后，取出细胞粘片，置于载玻片上，荧光倒置显微镜下观察估计其转染效率约为30％。 结论：HIF-1a-pcDNA3.1成功转染Hela，细胞，转染效率30％。筛选出稳定表达的HIF-1α-pcDNA3.1细胞株为后续研究奠定了实验基础。

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论文说明：英文缩略词

声明

前言

第一部分：HIF-1α基因克隆HIF-1α-pcDNA3.1表达载体的构建

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分：HIF-1α-pcDNA3.1表达载体转染Hela细胞研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述缺氧诱导因子-1与血管新生

致谢

攻读学位期间科研及获奖情况