在铜矿矿坑水微生物群落结构与功能研究中基因芯片技术的发展和应用

摘要

金属硫化矿的生物氧化作用导致了大量酸性浸矿水(AMD)的产生，并造成了无数的环境污染。同时，在AMD环境中生存着各种各样的嗜酸性微生物，这些微生物不仅参与了AMD的形成，同时也对金属的生物浸出及环境的生物治理具有重要的意义。本文从微生物群落的多样性及群落功能等方面对德兴铜矿酸性浸矿水进行了系统的研究。 本研究首先采用16S rRNA和gyrB基因作为分子标尺对来自德兴铜矿6个酸性浸矿水样品中微生物群落的多样性进行了研究。其结果显示，在德兴铜矿中的微生物主要属于Proteobacteria,Acidobacteria，Actinobacteria，Nitospira，Firmicute和Chlorella。通过主成分分析(PCA)发现，样品的地理化学变量对微生物群落的结构产生重要的影响。物理化学变量相似的样品中，其微生物群落结构更相似。通过典范相关分析(CCA)表明，其影响微生物群落结构变化的两个主要因素是铁和硫的浓度。但是，对微生物群落结构产生强烈影响的环境变量在不同的样点也各有不同。 通过比较16S rRNA和gyrB基因对微生物群落多样性的分析，揭示了gyrB基因在微生物群落结构研究中能够提供比16S rRNA更精确的信息，其更能反映微生物群落的本质。首先，我们利用两个不同矿区的酸性矿坑水样品对16S rRNA和gyrB基因在微生物群落多样性的应用进行了评估，其结果表明，两个分子标尺所显示的微生物群落组成基本相似。但就Shannon多样性指数而言，利用gyrB基因分析的微生物群落的多样性远远高于利用16S rRNA分析所得到的微生物群落丰度。在系统发育树分析上，gyrB基因能够很清楚地辨别那些关系很近的近亲菌株，这一点在纯培养A.ferrooxidans的分析中得到了进一步的验证。在以上分析的基础上，我们利用16S rRNA和gyrB基因对德兴铜矿4个AMD样品进行了分析，其结果也证明了上述观点。此外，我们也发现，在微生物群落的组成与地理化学变量相关性分析上，gvrB基因显示出更好的分析能力。 基因芯片技术因其独特的优势已被广泛应用于微生物群落结构与功能的研究中，但是，到目前为止，还没有有关基因芯片技术应用于酸性环境中的报道。为了有效的监控酸性环境和生物浸出系统中的微生物群落活动，基于已知的嗜酸细菌的基因序列我们开发了一种50mer寡核苷酸芯片，这一芯片包含了1072中独特的探针，其中包括571个16S rRNA探针和501个功能基因探针。这个芯片中的功能基因分别涉及到碳代谢(158)，氮代谢(72)，硫代谢(39)，铁代谢(68)，遗传(97)，金属抗性(27)，膜相关基因(16)，转座子(13)和IST序列(11)。并对其特异性、灵敏度及定量性能进行了评估。芯片杂交的结果显示，探针对于特定基因的PCR产物具有很强的特异性，在没有背景DNA存在的条件下，芯片对于基因组DNA的检测极限为5ng，芯片的信号强度和模板DNA的浓度之间存在着很强的线性关系(r<'2>=0.98)。此外，芯片与自然酸性环境和生物浸出系统中样品的杂交结果显示这种芯片能够有效的分辨酸性生态系统中微生物群落结构与功能的差异性。利用构建的基因芯片，我们对德兴铜矿酸性浸矿水样品进行了分析。其芯片上有关16S rRNA的结果与通过传统的16S rRNA PCR方法得到的结果保持一致。如，在SLS和YTW样品中，其优势种群主要为A.ferrooxidans；在芯片上，有关A.ferrooxidans菌的探针有很强的杂交信号。建立在16S rRNA的聚类分析显示，SLS和YTW聚在一块，两者有相似的微生物群落结构。这一结果与前面传统分子方法分析的结果也保持一致。通过功能基因进行聚类分析发现，一些与微生物能量代谢相关的基因聚在一块，有较强的杂交信号，这说明在AMD环境中微生物的能量代谢活动活跃，这与在这一环境中的微生物主要是利用亚铁或者硫作为能源有关，与此有关能量代谢的基因必然丰度很高。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1.1酸性矿坑水的来源及化学性质

1.1.1酸性矿坑水的来源及化学性质

1.1.2硫化矿物的溶解

1.2酸性浸矿水中微生物的多样性

1.2.1细菌和古菌

1.2.2真核生物

1.2.3 AMD环境中嗜酸性微生物的一般特征

1.2.4酸性矿坑水中嗜酸性微生物的代谢途径

1.2.5酸性矿坑水中嗜酸性微生物的金属耐受性能及抗性

1.2.6酸性矿坑水中嗜酸性微生物的丰度，群落结构以及与物理、化学特征的关系

1.3环境微生物多样性的基因组学分析方法

1.3.1基因的选择

1.3.2微生物多样性分析常用的基因组学方法及其优缺点

1.3.3基因芯片技术及其在环境微生物研究中的应用

第二章德兴铜矿酸性浸矿水中微生物群落的多样性及群落结构变化

2.1材料与方法

2.1.1采样点描述及样品收集

2.1.2地理化学参数分析

2.1.3群落基因组DNA的抽提、纯化以及16S rRNA基因的扩增和克隆

2.1.4序列测定及系统发育分析

2.1.5数据统计及分析

2.1.6核苷酸序列登记号

2.2结果

2.2.1样品的地理化学特征

2.2.2 RFLP分析

2.2.3系统发育分析

2.2.4微生物群落，地理距离和环境变量

2.3讨论

2.4小结

第三章16S RRNA和GYRB基因在分析微生物群落结构上的比较

3.1材料与方法

3.1.1样品描述和样品收集

3.1.2 A.ferrooxidans的培养

3.1.3 DNA抽提与纯化

3.1.4 16S rDNA和gyrB基因的PCR扩增

3.1.5 16S rRNA和gyrB基因的克隆和限制型酶切

3.1.6 DNA测序和系统发育分析

3.1.7数据分析

3.1.8核苷酸序列登记号

3.2结果

3.2.1 16S rDNA and gyrB基因克隆文库的RFLP分析

3.2.2微生物群落的系统发育分析

3.2.3 Acidithiobacillus ferrooxidans菌株的系统发育分析

3.3讨论

3.4小结

第四章利用16S RRNA和GYRB基因分析德兴铜矿酸性浸矿水中微生物群落结构研究

4.1材料与方法

4.1.1样点描述及样品采集

4.1.2水样的化学分析

4.1.3 DNA抽提及纯化

4.1.4 16S rRNA和gyrB基因的PCR扩增及纯化

4.1.5 16S rRNA和gyrB基因的克隆及限制性酶切

4.1.6序列测定和系统发育分析

4.1.7统计方法

4.1.8核苷酸序列登记号

4.2结果

4.2.1样点的地理化学变量

4.2.2 16S rRNA和gyrB基因克隆文库的RFLP分析

4.2.3主成分分析(PCA)

4.2.4系统发育分析

4.3讨论

4.4小结

第五章用于酸性矿浸水及生物浸出体系中微生物群落及功能分析的50MER寡核苷酸芯片的构建与评估

5.1材料与方法

5.1.1细菌及环境样品DNA的抽提和纯化

5.1.2 16S rRNA，iro，cbbQ，gyrB和pufM基因的PCR扩增和纯化

5.1.3芯片设计和构建

5.1.4 DNA的荧光标记

5.1.5芯片杂交

5.1.6图像处理和数据分析

5.2结果

5.2.1探针设计

5.2.2基因芯片的特异性评估

5.2.3基因芯片的灵敏度

5.2.4芯片杂交的定量性能

5.2.5运用50mer寡核苷酸基因芯片揭示酸性环境样品中的微生物群落结构

5.3讨论

5.4小结

第六章应用寡核苷酸基因芯片检测酸性浸矿水中微生物群落和功能

6.1材料与方法

6.1.1样品描述

6.1.2环境样品中DNA的抽提和纯化及定量

6.1.3 DNA的荧光标记

6.1.4芯片杂交

6.1.5图像处理和数据分析

6.2结果分析

6.2.1建立在基因芯片16S rRNA数据上的微生物群落分析

6.2.2应用基因芯片检测AMD样品中微生物群落的功能

6.3讨论与小结

参考文献

致谢

攻读博士学位期间所发表的论文