HBV相关性肝细胞癌外周血单个核细胞差异蛋白质组分析

摘要

目的：利用蛋白质组学方法建立分辨率高和重复性好的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)相关性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)、HBV相关性肝硬化(liver cirrhosis，LC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)及健康对照外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)图谱，识别鉴定其差异表达的蛋白质。为了验证比较蛋白质组学研究结果，对部分差异表达的蛋白质进行免疫印迹(Western blot)验证分析，并采用免疫组织化学技术检测部分差异表达的蛋白质在肝组织中的表达状况。寻找HBV相关性HCC早期诊断、癌变机制、治疗及预后监测的外周血特异性分子标志物。 方法： (1)采用密度梯度离心法分离HBV相关性HCC、LC、CHB及健康对照静脉血PBMC，用改良细胞裂解液裂解PBMC，抽取其总蛋白并利用蛋白质组学专用2-DE蛋白检测试剂盒测定总蛋白含量。 (2)利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离HBV相关性HCC(n=18)、LC(n=13)、CHB(n=12)及健康对照(n=10)PBMC的总蛋白质，先将固相化pH3-10NL梯度(immobilized pH gradient，IPG)干胶条进行第一向固相pH梯度等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)，取出IPG干胶条经平衡30min后进行第二向垂直十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，然后对2-DE凝胶进行蓝银染色并用LabScan扫描凝胶成像，接着采用PDQuest图像分析软件对2-DE凝胶图谱依次进行蛋白质斑点检测、背景消减、标准化、匹配、建立平均凝胶(matchset gel)、比较差异等分析并识别差异表达的蛋白质。选取部分差异表达的蛋白质应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption /ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF-MS)检测得到相应的肽质指纹图谱，最后搜索数据库鉴定差异蛋白质点。 (3)对部分差异蛋白质点采用Western blot进行验证分析。 (4)利用免疫组织化学技术对HBV相关性HCC、LC、CHB病人肝组织及对照肝组织分析部分差异蛋白质点在肝组织中的表达水平。 结果： (1)检测PBMC总蛋白的标准曲线回归方程为Y=0.0032X+0.37，R<'2>=0.998。 (2)得到了分辨率较高、重复性较好的HBV相关性HCC、LC、CHB及健康对照PBMC双向凝胶电泳图谱。HBV相关性HCC、LC、CHB及健康对照PBMC凝胶的平均蛋白质点数分别为1189±45、1016±41、1096±42及1123±39；组内的平均匹配率分别为91.6％、90.2％、90.7％及92.8％；同一组内3块胶在第一向IEF方向上位置的偏差较小，分别为1.21±0.14mm、1.06±0.12mm、1.09±0.15mm及0.99±0.12mm，在第二向SDS-PAGE方向上位置的偏差也较小，分别为2.22±0.26mm、2.15±0.2mm、1.93±0.20mm及1.98±0.24mm。 (3)HBV相关性HCC对比LC、CHB及健康对照PBMC凝胶的差异蛋白点，表达增强的个数分别是72±7、63±6及65±5，表达量降低的个数分别是34±5、24±4及27±4；随机选取至少在50％的凝胶中均有相同变化及表达量相差3倍以上的差异蛋白质点共28个，对其进行质谱分析，鉴定出19个蛋白质，在HBV相关性HCC病人PBMC中表达明显增强的有热休克蛋白质(heat shock protein，HSP)27、ras癌基因家族(RAB14)、肌动蛋白、α<,1>-抗胰蛋白及RNA结合蛋白调节亚基等15个蛋白点；而PDX2、PDX6、HSPA8及锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)在HCC病人PBMC中低表达。这些差异蛋白质点主要为蛋白质合成与分解、分子伴侣、解毒和DAN修复相关蛋白质、三大代谢相关酶类、细胞结构相关蛋白质以及信号传导相关蛋白质等六类。 (4)Western blot对差异表达蛋白质MnSOD及HSP27半定量分析结果与比较蛋白质组学研究结果一致。HBV相关性HCC与LC、CHB、健康对照及胃癌病人比较，PBMC中HSP27表达明显增高(P<0.01)，MnSOD表达量明显降低(P<0.01)。 (5)免疫组织化学结果显示，与对照肝组织相比，HSP27在HBV相关性HCC肝组织癌细胞中表达显著增强(P<0.01)；LC(P=0.15)及CHB(P=0.69)肝组织中HSP27的表达均很低，与对照肝组织相比均无明显差异。 结论： (1)成功地建立用蛋白质组学技术分析PBMC的实验方法。 (2)建立了分辨率高且重复性较好的HBV相关性：HCC、LC、CHB及健康对照PBMC双向凝胶电泳图谱。 (3)鉴定出差异表达蛋白质19个，表达明显增强有15个，明显下降的有4个，其中某些可能成为HBV相关性：HCC早期诊断、癌变机制、治疗及预后监测的外周血特异性分子标志物。 (4)HSP27在HBV相关性HCC、LC、CHB及健康对照PBMC中的表达水平与肝组织中表达情况类似，值得进一步研究。

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文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照表

声明

前言

第一章HBV相关性肝细胞癌外周血单个核细胞蛋白质双向电泳图谱的建立及差异分析

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二章部分蛋白质分子差异表达水平验证

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

结论

参考文献

综述 差异蛋白质组学在肝脏疾病中的研究进展

致谢

攻读学位期间主要的研究成果