大肠癌细胞自体荧光光谱特征分析及代谢影响因素的机制

摘要

大肠癌是临床上很常见的一种恶性肿瘤，改善其预后的关键因素是提高早期诊断率。利用激光诱导自体荧光(laser inducedautofluorescenae LIAF)技术对早期大肠癌进行诊断是一种新发展起来的诊断方法，具有灵敏、快速、简便、无创的特点。国内外已进行了广泛的基础和初步的临床研究，取得了较大的进展。 以往的研究大量集中在诱导大肠组织的自体荧光后，通过分析其光谱特征来区分正常组织和癌组织。比较一致的观点是：与组织自体荧光比较，细胞内自体荧光微弱，对诊断的意义不大。但癌变最初是发生在细胞内，当这种从正常向癌转化的过程积累到一定阶段，才突破细胞的界限发展到组织癌变。实际上在出现可以从形态学上观察到的病变之前，细胞的结构和功能已产生了不可逆的转变。如果细胞内自体荧光光谱特征能提示甚至诊断早期大肠癌，结合组织自体荧光光谱分析，无疑对提高早期大肠癌的诊断水平有很重要的意义。 细胞内主要的荧光物质如NAD、NADH、FAD等是线粒体呼吸链氧化磷酸化提供能量的反应中的辅酶/辅基或反应底物，因此，代谢水平的改变也必然影响到细胞自体荧光光谱的特征。 本研究的目的是了解大肠粘膜正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞的自体荧光光谱之间的差异，检验卫生部肝胆肠外科研究中心研制的第二代自体荧光诊断系统的精确度，在此基础上用一种数学模型来预测细胞自体荧光光谱的主要组成成分；检测细胞内与代谢反应有关的关键酶的活力、线粒体DNA的损伤、NADH脱氢酶亚基Ⅰ、Ⅱ以及细胞色素氧化酶亚基1 mRNA的表达以及碱基突变，从代谢的角度来探讨不同细胞的自体荧光光谱特征差异产生的原因，并与用数学模型预测的结果进行比较，以验证数学模型其可靠性。 第一部分：大肠粘膜细胞的分离、自体荧光光谱检测和分析 方法：从手术切除的标本分离出大肠粘膜正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞并用RPMI 1640培养基培养10天；以第二代自体荧光诊断系统和荧光分光光度计分别检测在370nm和440nm激发波长时细胞(108/ml)个的自体荧光光谱；比较分析不同细胞的荧光光谱波形、波峰位置和荧光强度以区分细胞，比较两种仪器测定结果的差异；用Matlab5.1软件设计数学程序，拟合NAD、NADH、FAD标准品以及细胞的自体荧光光谱曲线，建立预测细胞内主要的荧光物质NAD、NADH、FAD对荧光光谱的贡献率的数学模型，进行计算。 结果：1.从切除标本成功地分离出大肠粘膜正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞，培养10天发现癌细胞生长快速，不典型增生细胞数量亦缓慢持续增加，正常细胞的数量在第七天达到最高值后逐渐减少(P<0.05)；2.自体荧光诊断系统在370nm激发波长时测定的三种细胞自体荧光光谱波形均为类似正态分布，波峰位置在460nm左右(P>0.05)，正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞的荧光光谱波峰荧光强度分别为31.94、28.63、23.07，正常细胞>不典型增生细胞>癌细胞(P<0.05)；3.荧光分光光度计在370nm激发波长时测定的三种细胞自体荧光光谱与自体荧光诊断系统类似，波形也为类似正态分布，波峰位置在460nm左右(P>0.05)，正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞的荧光光谱波峰荧光强度分别为39.26、35.15、29.78，正常细胞>不典型增生细胞>癌细胞(P<0.05)，两种仪器检测结果的差别表现在细胞的荧光光谱波峰荧光强度上，相同细胞的光谱波峰荧光强度差值约为7(P<0.05)；4.在440nm激发波长时，细胞自体荧光光谱的波形仍为类似正态分布，但不同细胞荧光光谱的波峰位置和波峰荧光强度均无区别(P>0.05)；5.Matlab拟合的正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞的荧光强度积分分别为58.167、50.423、41.208，正常细胞>不典型增生细胞>癌细胞(P<0.05)，NAD、NADH、FAD标准品的荧光强度积分分别为7.056、5.2226、1.3507；6.预测NAD、NADH、FAD对正常细胞自体荧光光谱的贡献率分别为0.527、0.311、0.127，对不典型增生细胞为0.545、0.250、0.111，对癌细胞为0.591，0.224，0.102，相同细胞内的贡献率比较NAD>NADH>FAD，三种细胞间相比，NADH对总荧光强度的贡献率在正常细胞最高，在癌细胞最低(P<0.05)；NAD的贡献率在癌细胞最高，而在正常细胞最低(P<0.05)；PAD的贡献率在正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞基本相同(P>0.05)。 结论：1.激光诱发大肠粘膜细胞产生的自体荧光光谱的波形为一类似正态分布的曲线。2.大肠粘膜正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞的发射波峰位置无差异，波峰荧光强度和细胞总荧光强度积分存在差异，利用这种差异，第二代自体荧光诊断系统可以区分这三种细胞。3.大肠粘膜细胞的自体荧光光谱主要由细胞内NAD、NADH、FAD等三种荧光物质组成，它们在不同的细胞中对荧光的贡献率也不同。 第二部分：大肠粘膜细胞代谢水平的测定及分析 方法：用HO 33342和DiOC6两种荧光染色剂将大肠粘膜细胞的细胞核和线粒体染色，在荧光显微镜下观察细胞以及线粒体的形态；提取线粒体，用分光光度计测定107个细胞内的蛋白质浓度、乳酸脱氢酶(LDH)活力、琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素C氧化酶(COX)的比活力、NAD、NADH、FAD的含量。 结果：1.荧光显微镜下观察细胞和线粒体的形态，发现正常细胞线粒体含量丰富，而癌细胞中线粒体含量显著下降；2.正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞中的蛋白质浓度分别为2.17、3.95、7.22mg/ml，正常细胞<不典型增生细胞<癌细胞(P<0.05)；正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞LDH活力分别为1.36、4.91、10.61U/mg pro，正常细胞<不典型增生细胞<癌细胞(P<0.05)；正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞SDH比活力分别为120.52、103.11、79.62 U/(min·mgpro)，正常细胞>不典型增生细胞>癌细胞(P<0.05)；正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞COX比活力分别为54.73、43.05、10.19U/(min·mg pro)，正常细胞>不典型增生细胞>癌细胞(P<0.05)；正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞中NAD的含量分别为88.2、93.1、99.4ug/mg pro，正常细胞<不典型增生细胞<癌细胞(P<0.05)；正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞中NADH的含量分别为69.2、55.7、48.3ug/mg pro，正常细胞>不典型增生细胞>癌细胞(P<0.05)；正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞中FAD的含量分别为108.7、93.3、83.3ug/mg pro，正常细胞>不典型增生细胞>癌细胞(P<0.05)。 结论：1.癌细胞以无氧代谢为其主要代谢途径，LDH活力升高，SDH和COX比活力降低，蛋白质和NAD的含量增加，NADH和FAD的含量减少。2.在370nm激发波长条件下，细胞自体荧光光谱的特征主要是由NAD、NADH和FAD决定的，这三种荧光物质含量的高低使荧光光谱出现变化，可用来区分正常细胞和癌细胞。3.用Matlab拟合的各荧光物质对细胞自体荧光光谱的贡献率与真实检测结果基本符合，证明可用数学方法推断生物组织或细胞的状态。 第三部分：大肠粘膜细胞线粒体DNA损伤，NADH脱氢酶亚基Ⅰ、Ⅱ和细胞色素氧化酶亚基1 mRNA的表达水平及碱基突变的研究 方法：以碱变性法提取和纯化mtDNA，用微量紫外分光光度计测定mtDNA的浓度，酶解消化后，液相高效色谱仪检测mtDNA内的DNA氧化性损伤标志物8-OH-dG的含量；提取细胞总mRNA，一步法半定量RT-PCR检测NADH脱氢酶亚基Ⅰ、Ⅱ(ND Ⅰ、ND Ⅱ)和细胞色素氧化酶亚基1(CO1)mRNA的表达水平；RT-PCR产物测序，观察细胞中基因碱基突变的情况。 结果：1.大肠正常粘膜、不典型增生细胞和癌细胞的mtDNA的浓度分别为11.5，25.3、72.4ug/ml，正常细胞<不典型增生细胞<癌细胞(P<0.05)；2.正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞中8-OH-dG的含量分别为367.4、83.7、34.3/100000dG，正常细胞<不典型增生细胞<癌细胞(P<0.05)；3.半定量RT-PCR检测正常细胞、不典型增生细胞和癌细胞ND Ⅰ、ND Ⅱ、CO1mRNA的表达，均为正常细胞<不典型增生细胞<癌细胞(P<0.05)；4.不典型增生细胞和癌细胞ND Ⅰ、ND Ⅱ、CO1mRNA RT--PCR产物测序，共发现7个碱基点突变，其中有意义突变4个，无意义突变3个。 结论：1.大肠粘膜细胞癌变的过程中，线粒体容易受到活性氧(氧自由基)的损伤，mtDNA中氧化产物8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OH-dG)含量升高。2.在正常细胞向癌细胞转变时，mtDNA含量增加，其基因mRNA的表达亦增加，但由于基因内的碱基突变，使线粒体呼吸链氧化磷酸化反应出现异常，并形成恶性循环。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词简表

声明

第一部分：大肠粘膜细胞的分离、自体荧光光谱检测和分析

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

第二部分：大肠粘膜细胞代谢水平的测定及分析

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分：大肠粘膜细胞线粒体DNA损伤，NADH脱氢酶亚基Ⅰ、Ⅱ和细胞色素氧化酶亚基1mRNA的表达水平及碱基突变的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述 自体荧光技术诊断早期大肠癌的发展和现状

致谢

攻读博士学位期间的主要研究成果