反式白藜芦醇对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1的调控作用及其分子机制的研究

摘要

第一部分反式白藜芦醇对去卵巢大鼠骨量的影响及对MC3T3-E1细胞生长、分化、矿化及凋亡的作用 目的：反式白藜芦醇是在葡萄皮及红酒中存在的一种植物雌激素，具有多种生物活性作用。本研究旨在探讨反式白藜芦醇对去卵巢大鼠骨量的影响及在雌激素缺乏状态下对MC3T3-E1成骨样细胞的增殖、分化、矿化及凋亡的作用。 方法：48只SD大鼠随机分为6组，分为A组，接受假手术；B组，接受去卵巢手术；C组，去卵巢+0.03mg.kgbw-1·d-1己烯雌酚(DES)；D、E、F组，去卵巢+T-Res(分别为5、15和45mg·kgbw-1·d-1T-Res)处理90天，观察大鼠的骨密度变化。用无酚红DMEM培基模拟雌激素撤退，于培养液中加入不同浓度的反式白藜芦醇(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L，及10-5mol/L T-Res)以观察对小鼠颅骨成骨样细胞MC3T3-E1的作用。通过WST-8法反映细胞DNA合成；测定细胞内碱性磷酸酶活性、NO含量以反映细胞分化状况；测定细胞BGP含量，通过茜素红染色对矿化结节计数以反映细胞矿化程度；采用血清饥饿法诱导MC3T3-E1凋亡，通过RT-PCR反映凋亡相关基因bel-2及bax mRNA的表达。 结果：大鼠去卵巢后总体BMD及腰椎骨密度均显著低于假手术组(P<0.05)，反式白藜芦醇各组大鼠全身和腰椎BMD均显著高于去卵巢手术组(P<0.05)，45mg.kgbw-1·d-1 T-Res对大鼠骨量的保护作用最为明显。10-9～10-6mol/L反式白藜芦醇可促进MC3T3-E1细胞DNA合成。此外，10-8～10-5mol/L反式白藜芦醇可升高MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性、一氧化氮含量，骨钙素水平及矿化结节的形成。与血清饥饿组相比较，10-8～10-5mol/L反式白藜芦醇组的细胞bcl-2 mRNA表达显著升高(p<0.05)，而bax mRNA表达显著下降(p<0.05)。另一方面，10-5mol/L反式白藜芦醇可抑制MC3T3-E1细胞的增殖。 结论：10-8～10-6mol/L反式白藜芦醇可促进小鼠成骨样细胞MC3T3-E1生长、增殖、分化及矿化，并可抑制血清饥饿法诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。 第二部分反式白藜芦醇对MC3T3-E1细胞的分子调控机制 目的：成骨细胞在骨代谢中发挥着重要作用。本研究旨在从雌激素受体及OPG/RANKL两个途径来探讨反式白藜芦醇对MC3T3-E1的调控机制。 方法：用无酚红DMEM培基模拟雌激素撤退，于培养液中加入不同浓度的反式白藜芦醇(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L及10-5mol/L T-Res)以观察对小鼠颅骨成骨样细胞MC3T3-E1的部分基因和蛋白表达的作用，并加入雌激素受体拮抗剂(ICI182780)以观察白藜芦醇的雌激素样作用。通过RT-PCR技术检测ER-α、ER-β、转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、护骨素(OPG)及核因子-кB受体活化子配体(RANKL)mRNA的表达；通过western blotting技术检测测ER-β、OPG及RANKL蛋白的表达。 结果：MC3T3-E1可表达ER-α与ER-β，ICI182780可抑制雌激素受体的表达。与对照组比较，10-7-10-5mol/L反式白藜芦醇可上调MC3T3-E1细胞中ER-β、TGF-β1及Col-I mRNA表达(P<0.05)，但对ER-α无明显作用。在mRNA和蛋白水平，均可观察到10-7-10-5mol/L的反式白藜芦醇明显上调MC3T3-E1细胞中OPG的表达，下调RANKL的表达。反式白藜芦醇的这些调节作用均可被ICI182780所抑制。 结论：反式白藜芦醇对骨的保护作用与其对雌激素受体及OPG/RANKL途径的调控有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩略词表

声明

第一章 反式白藜芦醇对去卵巢大鼠骨量的影响及对MC3T3-E1细胞生长、分化、矿化及凋亡的作用

前言

1.1材料与方法

1.1.1主要仪器设备

1.1.2主要实验试剂及耗材

1.1.3试剂配置

1.1.4实验方法

1.1.5数据处理及统计分析

1.2结果

1.2.1动物实验结果

1.2.2体外细胞实验

1.3分析与讨论

1.3.1成骨细胞在绝经后骨质疏松骨代谢中的重要作用

1.3.2反式白藜芦醇对MC3T3-E1增殖、分化的影响

1.3.3反式白藜芦醇对MC3T3-E1成熟、矿化的作用

1.3.4反式白藜芦醇对成骨细胞凋亡的保护作用

1.4结论

第二章反式白藜芦醇对MC3T3-E1细胞的分子调控机制

前言

2.1材料与方法

2.1.1主要仪器设备

2.1.2主要实验试剂及耗材

2.1.3试剂配制

2.1.4实验方法

2.2结果

2.2.1反式白藜芦醇对MC3T3-E1细胞雌激素受体及相关因子的作用

2.2.2反式白藜芦醇对OPG/RANKL途径的调控作用

2.3讨论

2.3.1雌激素与绝经后骨质疏松症

2.3.2反式白藜芦醇对雌激素受体及相关因子的调控

2.3.3反式白藜芦醇对MC3T3-E1 OPG/RANKL/RANK信号途径的调控

2.4结论

参考文献

综述白藜芦醇的生物活性作用

致谢

攻读学位期间主要研究成果