大鼠CRX基因的重组慢病毒载体LV-Rho-EGFP/CRX的构建和表达

摘要

目的：构建在光感受器细胞特异表达的视紫红质启动子(Rho)驱动的大鼠视锥视杆细胞同源盒基因(CRX)为目的基因的重组慢病毒载体LV-Rho-EGFP/CRX，研究其在体外的转染效率，为今后视网膜光感受器细胞特异的靶向基因转移和基因治疗研究提供工具。 方法： 1.采用PCR技术从先前构建的载体pEGFP-C3/CRX中扩增出含EGFP/CRX基因的DNA片段，通过酶切、连接、转化取代慢病毒载体LV-Rho-EGFP中的EGFP片段，构建表达载体LV-Rho-EGFP/CRX，经酶切和双向测序验证。 2.利用磷酸钙沉淀法四质粒共转染293T细胞，利用有限稀释法计算慢病毒颗粒的滴度。 3.用慢病毒颗粒原液感染人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44，48小时后初步观察慢病毒颗粒的感染情况。 结果： 1.成功构建CRX基因的慢病毒表达载体LV-Rho-EGFP/CRX，经293T细胞包装后，慢病毒颗粒滴度为2×104 IU/ml。 2.用滴度为2×104 IU/ml的慢病毒感染人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44，感染48 h后，被感染的细胞内可见强弱不等的荧光。 结论： 重组载体LV-Rho-EGFP/CRX的慢病毒滴度达到2×104 IU/ml，能感染人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-RB44。

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论文说明：缩略词

声明

第一章前言

第二章材料与方法

2.1材料和试剂

2.2实验方法

2.2.1感受态的制备

2.2.2质粒转化、抽提

2.2.3 PCR法扩增EGFP/CRX目的片段

2.2.4 PCR产物的T/A克隆

2.2.5 重组载体LV-Rho-EGFP/CRX的构建、筛选和鉴定

2.2.6 293T细胞培养、消化、冻存与复苏

2.2.7慢病毒包装、滴度测定

2.2.8 RB细胞株HXO-RB44中Rhodopsin蛋白表达检测

2.2.9慢病毒感染靶细胞(HXO-RB44细胞)

附图

第三章结果

3.1慢病毒载体LV-Rho-EGFP/CRX的构建

3.2重组慢病毒载体的包装、收集和滴度的测定

3.3 HXO-RB44的细胞免疫荧光鉴定

3.4重组慢病毒感染HXO-RB44细胞株

第四章讨论

第五章结论

参考文献

综述 慢病毒载体在眼科基因治疗的应用

致谢