系统性红斑狼疮CD4+T细胞组蛋白修饰异常及SIRT1-siRNA对MRL-lpr/lpr狼疮鼠模型干预的研究

摘要

本文就系统性红斑狼疮CD4+T细胞组蛋白修饰异常及SIRT1-siRNA对MRL-lpr/lpr狼疮鼠模型干预的研究进行了论述，主要分以下几个方面： 第一部分狼疮T细胞组蛋白修饰异常的研究 第一节系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞组蛋白修饰异常的研究 目的：表观遗传学机制在人类疾病包括肿瘤、衰老和自身免疫病中扮演着重要角色。DNA甲基化，组蛋白修饰是表观遗传学修饰的主要方式，在基因调控中起重要作用。前期的研究发现系统性红斑狼疮(SLE)患者T细胞中基因组DNA及与自身免疫相关基因存在不同程度的低甲基化，本研究主要探讨SLE患者CD4+T细胞中核心组蛋白H3/H4乙酰化和H3K4/H3K9甲基化状态，组蛋白乙酰基转移酶(HATs)、组蛋白去乙酰基酶(HDACs)及组蛋白甲基转移酶(HMTs)表达水平以及对组蛋白乙酰化和甲基化状态的影响。 方法：20例系统性红斑狼疮患者均来自我院门诊，活动性患者10例，其中男1例，女9例，年龄14～41岁，平均年龄27.6±10.4岁，平均SLEDAI评分9.8±4.9分，非活动性患者10例，其中男2例，女8例，年龄15～58岁，平均年龄29.8±13.8，平均SLEDAI评分1.0±1.7分。正常对照组10例，男4例，女6例，年龄22～35岁，平均28.5±5.2岁，均为本院健康医务人员。采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞，H3/H4乙酰化及H3K4/H3K9甲基化检测试剂盒检测H3/H4乙酰化和H3K4/H3K9甲基化水平，实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)法检测CD4+T细胞组蛋白乙酰基转移酶(HATs)-EP300，CREBBP和PCAE，组蛋白去乙酰化酶(HDACs)-HDACl，HDAC2，HDAC4，HDAC5，HDAC7A和SIRT1，组蛋白甲基转移酶(HMTs)-SUV39H1、SUV39H2和EZH2基因tuRNA表达水平。 结果：与正常对照组比较，活动性狼疮患者CD4+T细胞组蛋白H3/H4均呈低乙酰化状态(P=0.002，P=0.009)，且组蛋白H3乙酰化水平与疾病活动程度呈负相关(R=-0.889，P=0.044)，活动性和非活动性狼疮患者CD4+T细胞H3K9甲基化水平显著降低(P=0.001，P=0.003)，而H3K4甲基化水平无明显改变(P>0.05)。此外，我们发现与正常对照组相比，活动性SLE患者CD4+T细胞SIRT1 mRNA表达水平明显增高(P<0.001)，而CREBBP，P300，HDAC2，HDAC7，SUV39H2，EZH2 mRNA表达水平显著降低(P<0.001，P<0.001，P=0.01，P<0.001，P=0.003，P=0.001)。非活动性SLE患者HDAC2，HDAC7，SUV39H2，EZH2 mRNA表达水平也显著降低(P=0.009，P<0.001，P=0.04，P=0.001)。 结论：CD4+T细胞组蛋白修饰如核心组蛋白H3/H4低乙酰化和H3K9低甲基化可能在SLE发病中起重要作用。 第二节 MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞组蛋白修饰酶谱的研究 目的：研究MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞中组蛋白乙酰化酶(HATs)、去乙酰化酶(HDACs)、组蛋白甲基化酶(HATs)表达是否存在异常? 方法：SPF级18周龄MRL/lpr狼疮鼠10只，另10只野生型MRL/MPJ小鼠为正常对照组，实时定量RT-PCR(real-time RT-PCR)法检测CD4+T细胞组蛋白乙酰基转移酶(HATs)-EP300，CREBBP和PCAF,组蛋白去乙酰化酶(HDACs)-HDAC1，HDAC2，HDAC4，HDAC5，HDAC7和SIRT1，组蛋白甲基转移酶(HMTs)-SUV39H1、SUV39H2和EZH2基因mRNA表达水平，Western印迹检测SIRT1蛋白表达。 结果：与野生型MRL/MPJ小鼠相比，MRL-lpr/lpr狼疮鼠CD4+T细胞P300，PCAF,HDAC7，SUV39H2和EZH2 mRNA显著降低(P=0.04，P=0.04，P=0.04，P=0.03，P=0.01)，SIRT1 mRNA表达显著增高(P=0.04)。Westem印记结果显示，MRL-lpr/lpr狼疮鼠CD4+T细胞SIRT1蛋白表达显著增高(P=0.01)，这些结果与系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞组蛋白修饰异常大体一致。 结论：狼疮鼠模型CD4+T细胞存在组蛋白乙酰化和甲基化修饰异常。 第二部分SIRT1-siRNA对MRL/lpr狼疮鼠模型组蛋白修饰异常的干预及其治疗作用 目的：探讨SIRT1-siRNA对MRL/lpr狼疮鼠模型组蛋白修饰异常的干预及其治疗作用。 方法：SPF级18周龄雌性MRL/lpr小鼠，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，用免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞，小鼠分成四组，每组3只进行动物模型试验，①MRL/lpr小鼠+SIRT1-siRNA注射组；②MRL/lpr小鼠+Control-siRNA注射组；③MRL/lpr+生理盐水注射组；④MRL/lpr小鼠未处理组。每50ug化学合成siRNA溶解于1ml PBS中，注射至小鼠尾静脉中，8h和24h重复注射一次。所有注射均采用鼠尾静脉流体力学转染技术。24h、5d、10d后采集各组小鼠外周血分离CD4+T细胞，采用实时定量PCR及Western blot技术检测SIRT1 mRNA及蛋白水平，EpigentekTM试剂盒检测组蛋白H3、H4乙酰化水平，酶联免疫吸附法(ELISA)法检测抗dsDNA抗体和抗核抗体(ANA)，用尿蛋白试纸法检测尿蛋白水平，采用直接免疫荧光法及HE染色病理切片检测小鼠肾脏损害情况。 结果： 1)与空白对照组比较，SIRT1-siRNA转染24h后小鼠CD4+T细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达水平下降(P=0.04，P=0.001)，5天后恢复基础水平。 2)SIRT1-siRNA干预后24h组蛋白H3、H4乙酰化水平显著增高(P=0.02，P=0.01)，并一直持续到第5天(P=0.04，P=0.04)，干预后第10天组蛋白H4乙酰化水平仍较空白组显著增高(P=0.001)。 3)SIRT1-siRNA干预后第10天抗dsDNA抗体水平明显降低(P=0.04)，抗核抗体(ANA)无明显改变(P>0.05)。 4)肾脏HE染色组织病理及免疫荧光结果显示SIRT1-siRNA干预后10天肾小管及血管病变均明显好转。同时，尿蛋白结果也较前好转。 5)与空白对照组比较，Control-siRNA组及生理盐水干预组小鼠CD4+T细胞SIRT1基因mRNA及蛋白水平，组蛋白H3、H4乙酰化水平，以及抗dsDNA抗体，抗核抗体(ANA)滴度均无明显变化(P均>0.05)，肾脏组织病理亦无明显改变。 结论：抑制去乙酰化酶SIRT1可在狼疮鼠体内纠正组蛋白低乙酰化状态，并有一定的治疗作用。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分狼疮T细胞组蛋白修饰异常的研究

第一节系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞组蛋白修饰异常的研究

前言

材料和方法

结果

第二节MRL/lpr狼疮鼠CD4+T细胞组蛋白修饰酶谱的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分SIRTl-siRNA对MRL/lpr狼疮鼠模型组蛋白修饰异常的干预及其治疗作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

ReviewI DNA methylation and autoimmunity

ReviewII The Interference of DNA Methylation

致谢

攻读博士学位期间发表的论文及研究成果